本文關(guān)鍵詞：藏綿羊DQA和DQB座位基因克隆、表達(dá)及其適應(yīng)性進(jìn)化研究　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：藏綿羊是中國(guó)最古老的綿羊品種之一,主要分布在海拔2500 m以上的青藏高原及其毗鄰的高寒牧區(qū),是青藏高原的主要畜種資源,也是當(dāng)?shù)厝嗣袢罕姷闹饕詈蜕a(chǎn)資料。由于近年來(lái)自然和人工因素的影響,藏綿羊的生產(chǎn)性能、抗病及抗逆等高原適應(yīng)特性呈現(xiàn)一定程度的下降趨勢(shì)。因此,開展藏綿羊的遺傳多樣性及其不同地理生態(tài)群體所采取的適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制研究對(duì)藏綿羊的保護(hù)利用和種質(zhì)創(chuàng)新以及遺傳改良是十分必要的。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是脊椎動(dòng)物中與機(jī)體免疫系統(tǒng)具有重要作用的功能基因家族之一,其所編碼的MHC分子具有遞呈抗原并觸發(fā)免疫反應(yīng)以及維持機(jī)體世代適應(yīng)環(huán)境變化的能力和功能,也是研究脊椎動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化研究的最佳遺傳標(biāo)記。本研究以5個(gè)藏綿羊生態(tài)群體(甘肅3個(gè)群體和青海2個(gè)群體)為研究對(duì)象,克隆測(cè)定藏綿羊DQA和DQB座位基因序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)DQA1、DQA2、DQB1和DQB2基因mRNA在18月齡甘南藏綿羊背最長(zhǎng)肌等17個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量,以及利用PCR-SSCP技術(shù)分析DQA1、DQA2、DQB1和DQB2基因遺傳特征,以期揭示其與藏綿羊高原適應(yīng)性進(jìn)化的機(jī)制。主要研究結(jié)果及結(jié)論如下:1.藏綿羊DQA和DQB座位基因克隆測(cè)序及生物信息學(xué)分析(1)藏綿羊DQA1和DQA2基因CDS區(qū)片段長(zhǎng)度為768 bp,編碼255個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為28.23 KD和29.83 KD,理論等電點(diǎn)(PI)分別為5.20和4.76。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)DQA座位的2個(gè)基因蛋白都屬分泌蛋白,且都具有較強(qiáng)的親水性,主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細(xì)胞膜中;在2個(gè)基因蛋白中共發(fā)現(xiàn)了27個(gè)磷酸化位點(diǎn),但未發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn);預(yù)測(cè)還發(fā)現(xiàn),在DQA蛋白中存在3個(gè)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域;二級(jí)結(jié)構(gòu)是以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主的混合型;基于氨基酸序列進(jìn)行的進(jìn)化分析,其與牛、山羊、馬等物種的同源性較低,與其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近一致。(2)藏綿羊DQB1和DQB2基因CDS區(qū)片段長(zhǎng)度為786 bp,編碼261個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為29.91 KD和30.05 KD,理論等電點(diǎn)(PI)分別為5.52和8.83。dqb座位的2個(gè)基因蛋白都屬分泌蛋白,且都具有較強(qiáng)的親水性,主要存在于細(xì)胞外、細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中;在2個(gè)基因蛋白中共發(fā)現(xiàn)了38個(gè)磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)糖基化位點(diǎn);預(yù)測(cè)還發(fā)現(xiàn),在dqb蛋白中存在4個(gè)結(jié)構(gòu)域和2個(gè)跨膜螺旋區(qū)域;二級(jí)結(jié)構(gòu)是以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主的混合型,基于氨基酸序列進(jìn)行的進(jìn)化分析,其與牛、山、馬等物種的同源性較低,與其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近一致。2.dqa和dqb座位基因mrna在藏綿羊不同組織中的表達(dá)量藏綿羊dqa和dqb座位的4個(gè)基因在其背最長(zhǎng)肌、大腦、肺和肝等17個(gè)組織中均有表達(dá),但表達(dá)水平具有組織特異性。其中,dqa1基因在背最長(zhǎng)肌、脾臟、腎上腺、腎臟、甲狀腺和卵巢組織中的呈現(xiàn)高度表達(dá),在肺、心臟、瓣胃、網(wǎng)胃和瘤胃組織中中等表達(dá);dqa2基因在脾臟、心臟和卵巢中的表達(dá)量最高,在肝、后腿肌肉、回腸和瘤胃組織中有中等量的表達(dá);dqb1基因在肝、回腸和卵巢組織中的表達(dá)量較多,在腎上腺和心臟組織中的表達(dá)量中等;dqb2基因在瓣胃、甲狀腺、脾臟、小腦和胰腺組織中的表達(dá)較多,在后腿肌肉組織中的表達(dá)量中等。3.基于dqa和dqb座位基因的藏綿羊適應(yīng)性進(jìn)化研究(1)藏綿羊dqa和dqb座位基因遺傳特征①藏綿羊5個(gè)群體的ola-dqa1基因第2外顯子中共存在16個(gè)等位基因,分別命名為dqa1*a、*b、……*o和*p。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),它們和已有綿羊dqa1基因序列具有很高的同源性,共存在54個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn),占分析序列位點(diǎn)總數(shù)的20.07%;在氨基酸序列中共有26個(gè)(32.50%)氨基酸發(fā)生變異。②藏綿羊5個(gè)群體的ola-dqa2基因第2外顯子的序列分析后發(fā)現(xiàn)了17個(gè)等位基因,分別命名為dqa2*a、*b、……*p和*q,其中,等位基因dqa2*i-*q在藏綿羊上首次發(fā)現(xiàn),dqa2*a-*h是已公布的ola-dqa2基因第2外顯子的已有序列;它們和已有綿羊dqa2基因序列具有很高的同源性。在序列分析中共發(fā)現(xiàn)71個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn),約占分析位點(diǎn)總數(shù)的29.34%。在氨基酸序列中共有41個(gè)(56.90%)氨基酸發(fā)生突變。③藏綿羊5個(gè)群體的ola-dqb1基因第2外顯子上確定了5個(gè)等位基因,分別指定為dqb1*a-*e。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn),它們和已有綿羊dqb1基因序列具有很高的同源性。在序列分析中共有61個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn),約占分析位點(diǎn)總數(shù)的21.79%,在氨基酸序列中共有36個(gè)(40.45%)氨基酸發(fā)生突變。④藏綿羊5個(gè)群體OLA-DQB2基因第2外顯子的序列分析后確定了21個(gè)等位基因,分別命名為DQB2*A、*B、……*T和*U。它們和已有綿羊OLA-DQB2基因座序列具有很高的同源性。在序列分析中共有48個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn),約占分析位點(diǎn)總數(shù)的18.68%;在氨基酸序列中共有31個(gè)(38.75%)氨基酸發(fā)生突變。(2)藏綿羊DQA和DQB座位基因選擇作用平衡選擇是維持藏綿羊OLA-DQA和DQB座位基因多態(tài)性的主要機(jī)制之一。OLA-DQA1、DQA2、DQB1和DQB2 4個(gè)基因的抗原結(jié)合位點(diǎn)(ABS)的非同義突變率均高于同義突變率,揭示藏綿羊DQA和DQB座位的4個(gè)基因均受到了平衡選擇的作用。(3)藏綿羊DQA和DQB座位基因重組基因重組是藏綿羊DQA座位基因的主要進(jìn)化模式之一,但在DQB座位基因中未發(fā)現(xiàn)重組事件。在DQA1等位基因序列中,檢測(cè)到2個(gè)重組事件,均由Max Chi方法檢測(cè)到;而在DQA2基因檢測(cè)到4個(gè)重組事件,有2個(gè)事件是由Max Chi和SiScan兩種方法檢測(cè)到。(4)藏綿羊DQA和DQB座位基因的群體結(jié)構(gòu)和種群分化基于DQA和DQB座位基因的分化系數(shù)表明,甘南甘加型藏綿羊與其他4個(gè)群體的分化顯著。根據(jù)AMOVA分析結(jié)果,將5個(gè)藏綿羊群體依據(jù)地理位置劃分為2個(gè)區(qū)域,即甘肅甘南群體(OLX、QKX和GJX)和青海群體(QHOLX和QHGYX),表明甘肅甘南和青海5個(gè)藏綿羊生態(tài)群體區(qū)域之間的變化大于同一區(qū)域不同群體間的變化,結(jié)果支持了此區(qū)域的劃分。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S826

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