本文關(guān)鍵詞：傳染性肌肉壞死病毒多肽1和凡納濱對蝦半乳糖凝集素及Akirin的功能研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：對蝦是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,但是病原微生物導(dǎo)致的疾病給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。因此,研究病原與對蝦的互作機(jī)制以及對蝦的抗病免疫機(jī)理對防御疾病以及促進(jìn)對蝦抗病育種工作具有重要的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用意義。本研究以傳染性肌肉壞死病毒(Infectious myonecrosis virus,IMNV)編碼的多肽1以及凡納濱對蝦的半乳糖凝集素和Akirin為對象,分別研究了三者在病毒感染以及對蝦抗菌免疫中的作用。傳染性肌肉壞死病是由傳染性肌肉壞死病毒引起的,主要感染對象是凡納濱對蝦�；疾ξr出現(xiàn)肌肉壞死、白濁并且在對蝦養(yǎng)成期會達(dá)到70%的累計(jì)死亡率。前期研究預(yù)測到IMNV基因組的開放閱讀框1編碼的多肽1(Peptide 1,P1)是一種雙鏈RNA(ds RNA)結(jié)合蛋白(ds RNA binding domain,ds RBD),但是P1在IMNV感染對蝦中的功能并不清楚。本研究通過P1及其突變體的原核表達(dá)、凝膠遷移阻滯試驗(yàn)、快速蛋白液相色譜、多角度光散射分析、RNA干擾報(bào)告試驗(yàn)、下拉試驗(yàn)等證明P1能通過結(jié)合ds RNA和小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)抑制宿主抗病毒的RNA干擾通路,很可能是IMNV破壞對蝦抗病毒免疫RNA干擾的一種途徑。半乳糖凝集素是一種重要的模式識別受體而Akirin是NF-κB通路下游的核轉(zhuǎn)錄輔助因子,因此本文還利用基因克隆、原核表達(dá)、RNA干擾、細(xì)菌的結(jié)合和吞噬試驗(yàn)等研究了凡納濱對蝦的半乳糖凝集素和Akirin在對蝦抗細(xì)菌免疫中的功能。本文主要內(nèi)容及結(jié)果如下:1.P1通過其C端“αβββα”型的ds RBD結(jié)合ds RNA由于起始密碼子的不確定性,P1可能存在長短不同的兩種蛋白,分別是LP1(Long P1,1-196 aa)和SP1(Short P1,56-196 aa)。本研究通過對LP1的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其N端有一個(gè)蛋白結(jié)合域,C端有一個(gè)“αβββα”型ds RNA結(jié)合域。為了驗(yàn)證P1是否有結(jié)合ds RNA的活性,本研究首先利用原核表達(dá)的LP1和SP1蛋白與90 bp的ds RNA進(jìn)行凝膠遷移阻滯試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)LP1和SP1均能結(jié)合ds RNA但是在膠孔處形成了大的復(fù)合體�？紤]到P1的N端預(yù)測到一個(gè)蛋白結(jié)合域,LP1和SP1可能通過其N端的蛋白結(jié)合域形成了同源多聚體,當(dāng)這一多聚體結(jié)合ds RNA后會形成更大的復(fù)合體。于是本研究僅利用不含蛋白結(jié)合域的P1的C端(SSP1,super short P1)進(jìn)行凝膠遷移阻滯試驗(yàn)證明SSP1結(jié)合ds RNA后遷移良好,不再停滯在膠孔。SSP1突變體的凝膠遷移阻滯試驗(yàn)進(jìn)一步證明了參與P1結(jié)合ds RNA的保守氨基酸(H128、K151、K154)。SSP1的梯度凝膠遷移阻滯試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),1分子SSP1能夠結(jié)合8-9 bp的ds RNA,這符合經(jīng)典的“αβββα”型ds RBD結(jié)合ds RNA的特征。2.LP1或SP1通過其N端的蛋白結(jié)合域形成了同源多聚體P1的凝膠遷移阻滯試驗(yàn)間接表明LP1或者SP1可能通過N端形成了同源多聚體。本研究進(jìn)一步對LP1的N端序列分析,發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)可能的蛋白互作基序(64-ILKLL-68和79-ILHLL-83)。為了驗(yàn)證P1是否形成了自身多聚體以及預(yù)測的蛋白互作基序是否參與了多聚體的形成,本研究利用原核表達(dá)的LP1、SP1、SSP1及LP1在蛋白互作基序處的突變體進(jìn)行的化學(xué)交聯(lián)試驗(yàn)初步表明LP1及SP1通過N端的蛋白結(jié)合域形成了同源多聚體,并且其N端的蛋白基序64-ILKLL-68和79-ILHLL-83參與了多聚體的形成。P1及其突變體的快速蛋白液相色譜進(jìn)一步證明了這一結(jié)果。SP1的多角度光散射分析證明其至少以自身二聚體的形式存在。3.P1通過結(jié)合ds RNA和si RNA抑制宿主抗病毒的RNA干擾免疫RNA干擾是真核生物抵抗病毒感染的一種重要的免疫途徑,而某些病毒會編碼蛋白抑制宿主的RNA干擾達(dá)到保護(hù)自身的目的。本研究利用以雙熒光素酶為基礎(chǔ)的RNA干擾(RNAi)報(bào)告試驗(yàn)證明P1的C端和N端能夠獨(dú)立地抑制ds RNA介導(dǎo)的RNAi。P1在ds RNA結(jié)合域的突變體的RNAi報(bào)告試驗(yàn)進(jìn)一步表明P1的C端抑制RNAi是因?yàn)槠淠芨偁幮缘亟Y(jié)合ds RNA,從而阻止ds RNA被宿主的核糖核酸內(nèi)切酶Dicer-2切割。除此之外,LP1和SSP1能夠抑制si RNA介導(dǎo)的RNAi。凝膠遷移阻滯試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SSP1結(jié)合21nt si RNA,從而阻止si RNA裝配到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體發(fā)揮作用�？傊�,P1能夠在ds RNA和si RNA水平上抑制宿主的RNA干擾免疫。4.P1定位于果蠅S2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LP1分布在果蠅S2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。病毒蛋白的類泛素化是其進(jìn)入細(xì)胞核的一種途徑。通過對LP1的序列進(jìn)行類泛素化預(yù)測發(fā)現(xiàn)其含有可能的類泛素化基序,但是利用不含類泛素化基序的SSP1進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)SSP1同樣可以進(jìn)入細(xì)胞核。而且體外的下拉試驗(yàn)以及免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)LP1并沒有結(jié)合到參與類泛素化反應(yīng)的凡納濱對蝦的UBC9蛋白和成熟體的類泛素分子。因此,P1的入核機(jī)制及是否被類泛素化還需要深入研究。5.凡納濱對蝦半乳糖凝集素基因的克隆及免疫功能研究本研究首次在凡納濱對蝦中克隆到了一種半乳糖凝集素(Litopenaeus vannamei galectin,Lv Gal)基因,預(yù)測其編碼蛋白有338個(gè)氨基酸,預(yù)測發(fā)現(xiàn)其N端含有一個(gè)保守的糖類結(jié)合域。Lv Gal的序列分析發(fā)現(xiàn)其含有典型的糖結(jié)合的基序H-NPR與WG-ER的部分氨基酸。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)Lv Gal組成性表達(dá)在所檢測各個(gè)組織中,在血細(xì)胞和鰓中的表達(dá)量較高。Lv Gal的m RNA在鰻弧菌刺激后的6和12小時(shí)表達(dá)上調(diào),這預(yù)示著其可能參與對蝦對細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答。本研究接著利用原核表達(dá)的Lv Gal進(jìn)行體外的細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Lv Gal能夠結(jié)合鰻弧菌和溶壁微球菌。細(xì)菌凝集試驗(yàn)表明Lv Gal能夠以金屬離子非依賴性的方式凝集鰻弧菌,但是并沒有發(fā)現(xiàn)Lv Gal對鰻弧菌和溶壁微球菌具有抑菌活性。最后的體內(nèi)試驗(yàn)表明Lv Gal促進(jìn)了對蝦血細(xì)胞對鰻弧菌的吞噬。因此,Lv Gal很可能是通過結(jié)合、凝集細(xì)菌并促進(jìn)血細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬而發(fā)揮作用的。6.凡納濱對蝦Akirin基因的克隆及免疫功能的初步研究Akirin是一種高度保守的核蛋白,其在果蠅中的免疫功能被認(rèn)為是促進(jìn)NF-κB依賴的抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄。本研究在凡納濱對蝦中克隆到了Akirin(Lv Akirin)并對其免疫功能進(jìn)行了初步研究。經(jīng)過預(yù)測分析,Lv Akirin有212個(gè)氨基酸,并且有兩處典型的核定位信號分別是N端的24 30:PHKRRC和78 81:KRRK。多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹表明Lv Akirin與日本對蝦的Akirin親緣關(guān)系較近。Lv Akirin組成性表達(dá)在所檢測的組織中,在精巢中表達(dá)量最高,其次是血細(xì)胞,這預(yù)示著Lv Akirin可能會像其他動(dòng)物的Akirin一樣,在對蝦發(fā)育和免疫應(yīng)答中起作用。Lv Akirin的m RNA在副溶血弧菌刺激后的2,6和24小時(shí)被檢測到表達(dá)上調(diào)。利用RNAi技術(shù)特異性沉默Lv Akirin后檢測相關(guān)抗菌肽基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)AA-K型抗脂多糖因子、P型甲殼素和對蝦素3a的表達(dá)出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)。這表明Lv Akirin可能影響了抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄。本研究揭示了傳染性肌肉壞死病毒編碼的多肽1抑制抗病毒免疫RNAi的原理及途徑,發(fā)現(xiàn)了凡納濱對蝦半乳糖凝集素在血細(xì)胞對病原菌吞噬中的功能,最后探索了凡納濱對蝦Akirin在對蝦抗菌肽基因轉(zhuǎn)錄中的可能作用。這為深入了解對蝦的抗病免疫機(jī)理以及促進(jìn)對蝦抗病選育工作提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S945.4

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本文編號：1320096