本文關(guān)鍵詞：犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒及狂犬病毒三聯(lián)多表位重組蛋白的構(gòu)建及其免疫效果研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：犬瘟熱(Canine distemper)、犬細(xì)小病毒病(Canine parvovirus enteritis)和狂犬病(Rabies)是三種主要的在全球范圍內(nèi)傳播的犬科、貓科動物疫病。目前針對三種疫病唯一有效的防控辦法就是疫苗免疫接種,但目前在臨床中使用的常規(guī)疫苗存在諸多不足之處。多表位疫苗是基于抗原表位氨基酸序列而制備的一種新型疫苗,因其安全性好、保護(hù)力強(qiáng)和應(yīng)答類型可調(diào)控等特點(diǎn),近年來備受關(guān)注。本研究的主要目的是構(gòu)建CDV、CPV和RV的主要保護(hù)性抗原多表位重組蛋白,利用原核表達(dá)技術(shù)進(jìn)行表達(dá),并對其免疫原性進(jìn)行研究。同時,也對新型免疫佐劑聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine,PEI)的免疫增強(qiáng)效果進(jìn)行了研究,為研制犬類CDV、CPV和RV病毒多表位重組疫苗奠定了基礎(chǔ)。本研究通過對已報道的多個有價值的CDV、CPV和RV的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位進(jìn)行分析和評價,最終選擇了 13個不同的表位用于構(gòu)建多表位重組蛋白。包括CDV的2個B細(xì)胞表位,2個Th細(xì)胞表位及1個CTL細(xì)胞表位;CPV的2個B細(xì)胞表位及1個Th細(xì)胞表位;RV的2個B細(xì)胞表位,1個模擬空間B細(xì)胞表位,2個Th細(xì)胞表位及1個CTL細(xì)胞表位。各候選表位按照一定規(guī)則排列后通過連接子GGGGS或KK連接以保持各表位的獨(dú)立構(gòu)象。對這些重組蛋白序列的親水性、抗原性、折疊性、表面可及性、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測分析,最終優(yōu)選出6個不易形成二級結(jié)構(gòu)、不易組成新表位的重組蛋白序列rP1、rP2、rP3、rP4、rP5和rP6。編碼這6個蛋白的基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后進(jìn)行全基因合成,再克隆至原核表達(dá)載體上,其中rP1、rP2和rP3克隆到pET-28a(+),rP4、rP5和rP6克隆到pET-30a(+)上。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明,上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL-21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均以包涵體的形式表達(dá)。Western blotting試驗(yàn)結(jié)果證明,經(jīng)鎳柱純化及蛋白復(fù)性操作,成功獲得了 6個含有His標(biāo)簽的高純度重組蛋白。6個重組蛋白和三個滅活病毒經(jīng)弗氏佐劑乳化后免疫4周齡BALB/c雌性小鼠,三免后14天采血制備鼠源多抗血清。ELISA和Western blotting試驗(yàn)結(jié)果顯示,6個蛋白能夠與各自免疫后的抗血清發(fā)生反應(yīng);同時也能和上述三種滅活病毒發(fā)生反應(yīng),證明這6個重組蛋白均具有較好的免疫原性。同時,ELISA和Western blotting結(jié)果還顯示,3個滅活病毒免疫小鼠制備得到的抗血清也能與6個蛋白分別反應(yīng),即滅活病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體能夠與6個重組蛋白反應(yīng),這表明重組蛋白中的B表位也能夠產(chǎn)生相應(yīng)的抗體�？贵w中和試驗(yàn)、血凝抑制(Hemagglutinationinhibition,HI)試驗(yàn)和快速免疫熒光灶抑制試驗(yàn)(Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)證明6個重組蛋白均能同時誘發(fā)小鼠產(chǎn)生針對CDV、CPV和RV的中和抗體。然而與CDV、CPV滅活病毒及RV的商業(yè)化疫苗組相比,6個重組蛋白產(chǎn)生的中和抗體的效價較低,具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。比較6個重組蛋白在小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的效價,結(jié)果顯示相對于其他4個蛋白,rP1和rP4能夠產(chǎn)生更高效價的中和抗體,但rP1和rP4組之間無顯著差異。為了研究不同佐劑對重組蛋白免疫增強(qiáng)效果的差異,本研究以rP4為免疫原分別與PEI佐劑、PEI + CpG佐劑、CpG佐劑、弗氏佐劑及鋁佐劑配伍,免疫4周齡BALB/c雌性小鼠,以不加佐劑組為對照。在3免后第2、4、6和8周采血制備鼠源多抗血清。ELISA檢測不同時期抗血清中特異性抗體的滴度,結(jié)果表明五種佐劑均能增強(qiáng)rP4誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體的能力與不使用佐劑組相比差異極顯著。免疫增強(qiáng)效果為:弗氏佐劑PEI + CpGPEI鋁佐劑CpG。各佐劑組特異性抗體均持續(xù)8周不消減,而不加佐劑組在第8周時降低。ELISA分別檢測不同組3免后第2周抗血清中IgG1和IgG2a抗體亞型并計算其比值。通過比值分析可知,弗氏佐劑傾向于協(xié)助rP4誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫,鋁佐劑傾向于協(xié)助rP4誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫,而PEI傾向于誘導(dǎo)rP4產(chǎn)生平衡的體液免疫與細(xì)胞免疫,與CpG聯(lián)用時,PEI協(xié)助rP4誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)向細(xì)胞免疫傾斜。綜上所述,本課題首次成功構(gòu)建、表達(dá)和純化出了 6個含有CDV、CPV和RV病毒B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的重組表位蛋白,這6個蛋白均具有良好的免疫原性,可同時誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對三種病毒的中和抗體。同時本研究還證明,PEI+CpG作為多表位重組蛋白的佐劑具有很強(qiáng)的免疫增強(qiáng)作用。上述研究結(jié)果為CDV、CPV和RV病毒多表位重組疫苗的研究奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.655

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本文編號：1317769