本文關(guān)鍵詞：水稻中調(diào)控抽穗期的關(guān)鍵基因OsCOL13的克隆與生化分析　出處：《湖南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：水稻(Oryza sativa)作為重要的糧食作物之一,為全世界數(shù)十億的人提供能量。水稻是一個短日照植物,在開花方面表現(xiàn)出強(qiáng)烈的光周期敏感性。開花在植物整個生命周期中起著重要的作用,它決定了植物對不同外部環(huán)境的適應(yīng)性,同時也受到內(nèi)部信號和外界環(huán)境刺激的影響。在所有的開花調(diào)控因子中,光周期是最重要且被廣泛研究的影響因素。目前許多參與到光周期途徑的基因已經(jīng)在長日照植物擬南芥以及短日照植物水稻中被鑒定出來,同時建立起了Os GI/GI-Hd1/CO-Hd3a/FT信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中CONSTANS(CO)作為擬南芥的開花整合子在長短日照條件下都促進(jìn)開花。但水稻中CO的同源基因Heading date1(Hd1)卻起到雙重相反的功能,它在長日照條件下抑制開花,在短日照條件下誘導(dǎo)開花。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一個水稻CONSTANS-like(COL)基因OsCOL13,它參與到水稻光周期開花調(diào)控過程中。為了研究OsCOL13在開花調(diào)控中所起的作用,我們通過遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞學(xué)等技術(shù)手段對OsCOL13的功能進(jìn)行了深入解析。主要研究結(jié)果如下:(1)OsCOL13抑制水稻開花。無論在短日照條件(14 h黑暗/10 h光照)還是在長日照條件(10 h黑暗/14 h光照)下,OsCOL13過表達(dá)植株都比野生型Kitaake延遲開花3周左右。同時,將OsCOL13基因過表達(dá)到另外兩種光周期敏感的粳稻品種中花11和W030中,轉(zhuǎn)基因植株開花時間也顯著延遲。利用CRISPR-Cas9技術(shù)我們獲得了三個獨立的OsCOL13突變體,但突變體與野生型相比開花時間沒有明顯變化,暗示OsCOL13可能與其它的Os COL基因存在功能冗余。(2)OsCOL13主要在葉片、葉鞘、莖桿以及穗子中表達(dá),在根中相對比較低,同時在不同發(fā)育階段葉片中的表達(dá)維持穩(wěn)定。此外,GUS組織化學(xué)染色實驗發(fā)現(xiàn),在所有組織中都能檢測到GUS活性,暗示OsCOL13組成型表達(dá)。原位雜交顯示OsCOL13在葉片的葉肉細(xì)胞中大量表達(dá)。(3)OsCOL13是一個節(jié)律表達(dá)的基因,其表達(dá)受到光照和節(jié)律鐘的調(diào)控。OsCOL13的轉(zhuǎn)錄水平在長短日照下都是從傍晚開始積累,在黎明時達(dá)到最大,之后迅速降低直至傍晚。OsCOL13的表達(dá)在整個營養(yǎng)生長階段沒有太大的變化,并且長日照下的表達(dá)量要高于短日照條件下的表達(dá)量,同時在全光照條件下OsCOL13能維持節(jié)律性振幅也沒有改變,而在全黑暗條件下雖然還能維持節(jié)律表達(dá),但其振幅急劇減少。(4)通過在水稻原生質(zhì)體中觀察OsCOL13-GFP融合蛋白的熒光信號,發(fā)現(xiàn)OsCOL13嚴(yán)格的定位于細(xì)胞核中,與核參照蛋白D53-m Cherry完全重疊。OsCOL13-BD融合蛋白與BD對照相比在酵母菌株AH109中展現(xiàn)出更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性,并且激活域位于B-box和CCT兩個保守的結(jié)構(gòu)域之間,與已報道的CO和DTH2相類似。這些結(jié)果表明,OsCOL13可能作為一個轉(zhuǎn)錄激活子調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。(5)OsCOL13與自身互作,以同源二聚體的形式行使功能。當(dāng)用Flag標(biāo)簽抗體檢測過表達(dá)植株中OsCOL13-Flag融合蛋白時,我們發(fā)現(xiàn)一條約為70 k Da的條帶,它是OsCOL13-Flag單體蛋白的兩倍。隨著提取緩沖液中DTT濃度的增加,70 k Da條帶逐漸減弱,而一條35 k Da的條帶逐漸增強(qiáng)。暗示OsCOL13可能以二聚體的形式存在。此外,體外pull-down和Bi FC實驗進(jìn)一步證實OsCOL13可以形成二聚體。(6)OsCOL13在水稻開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中位于Osphy B的下游Ehd1的上游。OsCOL13作為一個組成型的負(fù)調(diào)節(jié)子,通過下調(diào)Ehd1的表達(dá)進(jìn)而抑制Hd3a和RFT1的表達(dá),從而延遲開花,并且獨立于其它的Ehd1調(diào)節(jié)子。通過在水稻開花相關(guān)的近等基因系以及突變體中檢測OsCOL13的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)OsCOL13的表達(dá)量在osphyb突變體中顯著降低,暗示Osphy B可能促進(jìn)OsCOL13的表達(dá)。(7)OsCOL13直接調(diào)控OsLBD38的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)OsLBD38基因可能直接受OsCOL13的調(diào)控。染色質(zhì)免疫共沉淀以及螢火蟲熒光素酶實驗進(jìn)一步證實,OsCOL13直接結(jié)合到OsLBD38的啟動子上調(diào)控它的表達(dá)。但OsLBD38過表達(dá)植株的開花時間與野生型相比差異不顯著,暗示OsLBD38受到OsCOL13的直接調(diào)控,在水稻體內(nèi)發(fā)揮其它未知的功能。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S511;Q943.2

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本文編號：1315753