本文關(guān)鍵詞：亞硝酸鹽誘導(dǎo)水稻胚性愈傷組織的作用及其分子機(jī)理　出處：《武漢大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：水稻是重要的糧食作物,也是重要的單子葉模式植物。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是研究水稻功能基因組學(xué)最常用的手段之一,而建立穩(wěn)定、高效的組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是其前提和基礎(chǔ)。影響水稻組織培養(yǎng)的因素很多,例如外植體的取材季節(jié)、取材部位、生理狀態(tài)、基因型、培養(yǎng)基中鹽類的組成及濃度、有機(jī)添加物的種類、生長調(diào)節(jié)劑的不同組合及配比等。氮源是組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中必不可少的成分,但亞硝酸鹽能否作為培養(yǎng)基的氮源成分未見報(bào)道,本研究系統(tǒng)分析了不同氮源對水稻愈傷組織生長和發(fā)育的影響,獲得的主要研究結(jié)果如下:以不同組合的硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、谷氨酰胺作為培養(yǎng)基氮源,以愈傷組織的誘導(dǎo)重量、繼代增重倍數(shù)和分化率作為生長評價(jià)指標(biāo),檢測不同氮源對水稻愈傷組織的表型影響。結(jié)果顯示銨鹽和谷氨酰胺單獨(dú)或一起作為氮源均不能誘導(dǎo)愈傷組織形成、愈傷組織繼代的增重倍數(shù)較低、愈傷組織不能分化成苗,其中銨鹽在分化過程中甚至不能使愈傷組織轉(zhuǎn)綠,而低濃度的亞硝酸鹽(2 mM、5 mM)作為氮源效果優(yōu)良,在排除了鉀鹽和可能存在的硝酸鹽污染后,明確了NO_2~-發(fā)揮作用的可靠性。檢測不同的培養(yǎng)階段、不同的氮源培養(yǎng)基對愈傷組織中可溶性蛋白、硝酸鹽含量、亞硝酸鹽含量的影響。結(jié)果顯示不同氮源培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織中可溶性蛋白含量不受氮源影響;在繼代和分化階段,以亞硝酸鹽或硝酸鹽作為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織中亞硝酸鹽的含量在前三天有明顯升高、第三天達(dá)到峰值、之后呈下降的趨勢,而僅以銨鹽或谷氨酰胺作為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織中亞硝酸鹽含量無顯著變化;在一定的濃度范圍內(nèi),愈傷組織中亞硝酸鹽的含量與其生長指標(biāo)正相關(guān),而硝酸鹽的含量與生長指標(biāo)不相關(guān)。鎢酸鈉特異性抑制硝酸還原酶(nitrate reductase,NR)的活性,利用此原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明隨著培養(yǎng)基中鎢酸鈉濃度的升高,對以硝酸鹽作為氮源的愈傷組織生長發(fā)育的抑制作用越大,其原因是細(xì)胞內(nèi)亞硝酸鹽含量的逐漸降低;而鎢酸鈉濃度的升高對以亞硝酸鹽作為培養(yǎng)基氮源的愈傷組織的生長發(fā)育無顯著性抑制,其原因是細(xì)胞內(nèi)亞硝酸鹽含量無顯著變化。以受硝酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)的四個(gè)基因?yàn)榇?檢測它們在不同氮源培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代和分化培養(yǎng)的愈傷組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示它們在以硝酸鹽或亞硝酸鹽作為氮源的愈傷組織中高表達(dá),而在僅以銨鹽作為氮源的愈傷組織體內(nèi)低表達(dá),表明亞硝酸鹽可能是真正誘導(dǎo)這些基因表達(dá)的物質(zhì),而非硝酸鹽。根據(jù)以上所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測,亞硝酸鹽極有可能對水稻愈傷組織的形態(tài)建成起信號分子的作用,而非硝酸鹽。檢測培養(yǎng)基的硝銨比對水稻愈傷組織的表型及其體內(nèi)亞硝酸鹽含量的影響,仍以愈傷組織的誘導(dǎo)重量、繼代增重倍數(shù)和分化率作為生長評價(jià)指標(biāo),結(jié)果顯示在總氮量相同的情況下,粳稻中花11(簡稱ZH11)的愈傷組織在硝銨比為4:1時(shí)生長最好,同時(shí)愈傷組織中亞硝酸鹽的含量最高;秈稻9311的愈傷組織在硝銨比為2:1時(shí)生長最好,同時(shí)愈傷組織中亞硝酸鹽的含量最高。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),N6培養(yǎng)基是粳稻組織培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)基,MS培養(yǎng)基及其改良培養(yǎng)基是秈稻組織培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)基,而培養(yǎng)基之間最大的不同即在于無機(jī)總氮量和硝銨比的不同,N6和MS培養(yǎng)基的硝銨比分別是4:1和2:1。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為此經(jīng)驗(yàn)做法提供一個(gè)解釋,即不同的硝銨比極可能影響了愈傷組織中亞硝酸鹽的含量,而亞硝酸鹽作為某種與生長發(fā)育有關(guān)的信號分子最終影響了愈傷組織的表型性狀。確定愈傷組織中一氧化氮(NO)與亞硝酸鹽的上下游信號分子的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,愈傷組織中NO的含量與亞硝酸鹽含量正相關(guān),體外添加濃度逐漸增大的亞硝酸鹽導(dǎo)致酶上清液中檢測到NO特異性熒光成比例的增加,說明亞硝酸鹽很可能是愈傷組織中NO的主要來源。若除去愈傷組織中的NO,則成熟胚無法誘導(dǎo)出愈傷組織、愈傷組織不能分化,說明NO極可能也是水稻組織培養(yǎng)中一種與生長發(fā)育有關(guān)的信號分子。在9311愈傷組織繼代培養(yǎng)過程,NO供體亞硝基鐵氰化鈉(SNP)可以調(diào)節(jié)愈傷組織中NO的含量,以SNP、SNP+谷氨酰胺、SNP+銨鹽作為培養(yǎng)基氮源對愈傷組織的繼代增重倍數(shù)無顯著性影響,但SNP+亞硝酸鹽作為培養(yǎng)基氮源對愈傷組織的繼代增重倍數(shù)有顯著性提高,表明NO在亞硝酸鹽的下游發(fā)揮作用,愈傷組織中合適濃度的亞硝酸鹽是NO發(fā)揮作用的前提。為了解培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的添加對愈傷組織轉(zhuǎn)錄組的影響進(jìn)行了 RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序。在繼代過程,亞硝酸鹽對有關(guān)苯基丙烷類物質(zhì)合成的次級代謝通路影響大,造成多數(shù)基因下調(diào)表達(dá),這與體外檢測亞硝酸鹽降低愈傷組織木質(zhì)素含量的結(jié)果相符,木質(zhì)素的降低有利于愈傷組織向胚性化方向發(fā)展。在分化過程,僅以亞硝酸鹽為氮源的愈傷組織中與逆境、脅迫、病害相關(guān)的基因大多會上調(diào)表達(dá),α-淀粉酶前體基因上調(diào)表達(dá),同時(shí)它對激素合成、代謝及細(xì)胞壁合成相關(guān)基因表達(dá)有很明顯影響。綜上所述,本研究進(jìn)行了亞硝酸鹽在水稻組織培養(yǎng)中的開拓性工作,重新認(rèn)識了亞硝酸鹽在植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中的作用,證實(shí)亞硝酸鹽不僅可以作為水稻組織培養(yǎng)的氮源營養(yǎng)成分,同時(shí)極有可能作為信號分子參與愈傷組織表型性狀的調(diào)控,這對水稻組織培養(yǎng)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值,其相關(guān)的分子轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有待進(jìn)一步地研究。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S511

【參考文獻(xiàn)】

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1 王莉江,明小天,安成才,苑華毅,陳章良;秈稻明恢63成熟種子愈傷組織的誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)基因水稻的抗性檢測[J];生物工程學(xué)報(bào);2002年03期

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本文編號：1314727