本文關(guān)鍵詞：MiR-26家族對奶山羊乳腺脂肪酸代謝的調(diào)控作用研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：MiR-26家族屬于內(nèi)含子miRNA,位于羥基末端RNA聚合酶Ⅱ多肽小磷酸酶(CTDSP)家族基因的內(nèi)含子區(qū)。MiR-26a-1定位于3號染色體,位于CTDSPL基因的第5內(nèi)含子;MiR-26a-2定位于5號染色體,位于CTDSP2基因的第4內(nèi)含子;MiR-26b定位于2號染色體,位于CTDSP1基因的第4內(nèi)含子;miR-26a-1和miR-26a-2的成熟體miRNA序列相同。MiR-26可直接作用于LXR的靶基因ABCA1和ARL7,參與細胞膽固醇外流過程;在脂肪細胞中,miR-26b的表達量受到腫瘤壞死因子、瘦素及抑制素的調(diào)控,抑制miR-26b會阻礙脂肪細胞的分化,降低脂合成marker基因C/EBPα和PPARG表達量,下調(diào)細胞內(nèi)甘油三酯和脂滴的積累。乳腺作為一種特殊的白色脂肪組織,在泌乳過程中脂肪酸代謝非�；钴S,因此,奶山羊miR-26家族的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究對揭示反芻動物乳脂形成的機制具有重要意義,為探討miRNA在乳腺脂肪酸代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要作用奠定基礎(chǔ)。本研究在分析泌乳中期乳腺組織miR-26及宿主基因表達量與乳成分及乳脂肪酸成分含量相關(guān)性的基礎(chǔ)上,通過miRNA類似物和抑制劑介導(dǎo)的超表達和干擾技術(shù)探討miR-26a和miR-26b對乳腺脂肪酸代謝的調(diào)控作用,并同時干擾miR-26及其宿主基因家族探究其對脂肪酸代謝的協(xié)同調(diào)控作用;通過對山羊miR-26家族基因啟動子的克隆和突變研究,以及脂代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子對miR-26家族DNA甲基化水平的影響,系統(tǒng)研究上游調(diào)控因子對miR-26家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。本研究的主要結(jié)果如下:1.山羊miR-26家族生物信息學(xué)分析及其與乳成分和乳脂肪酸成分的相關(guān)性研究對miR-26家族同源性分析結(jié)果表明,miR-26家族在山羊、牛、人、小鼠、綿羊中高度保守,且具備相同的種子序列。利用Target Scan和Pic Tar在線軟件預(yù)測miR-26家族的靶基因,并利用Kobas在線軟件的GO和KEGG模塊對靶基因的功能進行富集,結(jié)果表明miR-26家族的靶基因參與到Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Hippo信號通路(Hippo signaling pathway)、m TOR信號通路(m TOR signaling pathway)、脂肪酸合成通路(Fatty acid biosynthesis)等與乳脂代謝重要的信號通路中。在不同泌乳時期分析miR-26及其宿主基因(CTDSP)家族表達量表明,miR-26及CTDSP家族在泌乳期的表達量顯著高于干奶期,在泌乳盛期表達量達到最高峰,且表達趨勢一致。在泌乳中期對miR-26a/b與CTDSP1/2/L表達量進行皮爾遜相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)miR-26a與miR-26b呈現(xiàn)出極強的正相關(guān)性,且miR-26a與CTDSP2、miR-26a與CTDSPL、miR-26b與CTDSP1呈現(xiàn)顯著中度相關(guān)。miR-26及CTDSP家族與乳成分及乳脂肪酸成分含量相關(guān)性分析表明,miR-26a/b和CTDSPL與乳中總脂固形物含量顯著中度相關(guān),而與乳產(chǎn)量、乳糖、乳蛋白及非脂固形物無顯著相關(guān)性;miR-26a與C6:0、C14:1、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1及C18:3,miR-26b與C6:0、C14:1、C16:1、C18:0及C18:3,CTDSP1與C10:0、C11:0、C12:0、C14:0、C15:0、及C18:3,CTDSP2與C14:1,CTDSPL與C6:0、C14:1、C16:1、C18:0及C18:1均呈現(xiàn)中度相關(guān)。2.山羊miR-26家族對脂肪酸代謝的協(xié)同調(diào)控作用研究在原代山羊乳腺上皮細胞(GMEC)中單獨轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-26b mimic后,與對照組相比miR-26a和miR-26b表達量顯著上調(diào),脂肪酸從頭合成(FASN、ACACA)、甘油三酯合成(GPAM、DGAT1和LPIN1)、脂肪酸去飽和(SCD1和FADS2)、脂肪酸合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(PPARG、SREBP1和LXRA)和脂滴形成(PLIN2)相關(guān)基因的表達量顯著上調(diào);細胞內(nèi)甘油三酯含量和脂滴積累增加;不飽和脂肪酸C16:1和C18:2含量顯著增加,飽和脂肪酸C16:0含量顯著降低;且脂肪酸合成相關(guān)基因PPARG、SREBP1、FASN和SCD1基因DNA甲基化水平下降。與miR-26a處理組相比,miR-26a和miR-26b共同轉(zhuǎn)染細胞后脂合成相關(guān)基因FASN、GPAM、DGAT1、LPIN1、FADS2、SREBF1、PIN2的表達水平顯著上調(diào),且細胞中脂滴積累增加。相對于miR-26b處理組,miR-26a和miR-26b共同處理組脂合成相關(guān)基因FASN、ACACA、LPIN1、SCD1、FADS2、PPARG、SREBF1表達量顯著上調(diào),且不飽和脂肪酸C18:1含量顯著上調(diào),飽和脂肪C16:0含量顯著下調(diào)。靶基因預(yù)測結(jié)果表明,胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)是miR-26家族影響脂肪酸代謝的一個潛在靶基因,RT-q PCR和Western blot實驗表明,激活miR-26家族,INSIG1的m RNA和蛋白水平均顯著下調(diào),且熒光素酶實驗結(jié)果表明,miR-26家族可以直接作用于INSIG1基因3′-UTR。3.山羊miR-26及宿主基因家族對脂肪酸代謝的調(diào)控作用研究設(shè)計并合成miR-26家族inhibitor和特異性靶向CTDSP1、CTDSP2和CTDSPL基因的si RNA,轉(zhuǎn)染GMEC后,miR-26和CTDSP家族的表達量顯著下調(diào)(大于70%);抑制miR-26a或miR-26b,脂合成相關(guān)基因FASN、ACACA、GPAM、LPIN1、DGAT1、SCD1、PLIN2、CD36、PPARG、SREBP1、LXRA表達量均顯著下調(diào),靶基因INSIG1表達量顯著上調(diào),導(dǎo)致甘油三酯含量和脂滴積累減少,細胞內(nèi)C16:0、C18:0含量顯著增加,而C16:1和C18:1含量顯著下降,當共同轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-26b抑制劑時,對以上脂肪酸合成相關(guān)指標的影響具有協(xié)同抑制作用。轉(zhuǎn)染CTDSP家族si RNA后,脂合成相關(guān)基因(如SREBP1)顯著下調(diào),ISNIG1基因顯著上調(diào),甘油三酯含量、脂滴積累、不飽和脂肪酸C16:1和C18:1含量顯著下降,飽和脂肪酸C16:0含量顯著增加,同時干擾miR-26a/b及其宿主基因后,對脂合成相關(guān)基因CD36、FASN、LXRA和SREBP1的表達量具有協(xié)同抑制作用。4.山羊miR-26a啟動子與脂代謝重要轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系研究分別克隆得到miR-26a-1和miR-26a-2基因5′側(cè)翼序列1274 bp和1183 bp,對啟動子序列上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和Cp G島進行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)miR-26a-1啟動子上分別含有三個PPRE和SRE位點,含有一個典型的Cp G島;miR-26a-2啟動子上含有三個PPRE、三個SRE和一個LXRE位點,含有兩個典型的Cp G島。超表達SREBP1、PPARG和LXRA可顯著上調(diào)miR-26a和CTDSP2/L表達水平,下調(diào)miR-26a-1和miR-26a-2啟動子DNA甲基化水平。熒光素酶活性試驗結(jié)果表明,激活SREBP1、PPARG和LXRA可顯著上調(diào)miR-26a-1和miR-26a-2啟動子活性。缺失突變結(jié)果表明,miR-26a-1啟動子上PPRE1、SRE1或SRE2位點的突變可導(dǎo)致啟動子活性顯著下降;PPRE1突變后,激活PPARG表達并不能上調(diào)啟動子活性;SRE1或SRE2位點突變,導(dǎo)致SREBP1對miR-26a-1啟動子的激活作用減弱,同時突變SRE1和SRE2,SREBP1對其啟動子活性無激活作用。Ch IP實驗結(jié)果表明,SREBP1蛋白可與miR-26a-1啟動子上的SRE1和SRE2位點結(jié)合,直接參與miR-26a-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;SRE1和SRE2同時突變,LXRA對啟動子活性無影響,表明LXRA通過SREBP1間接調(diào)控miR-26a-1的表達。利用相同方法證明miR-26a-2啟動子上PPRE3、SRE1位點對其啟動子活性的維持具有重要作用。LXRE突變,LXRA對啟動子活性的激活作用減弱,而同時突變LXRE和SRE1導(dǎo)致LXRA對miR-26a-2啟動子的激活作用消失,表明LXRA通過直接和間接兩種方式參與調(diào)控miR-26a-2的表達。5.山羊miR-26b啟動子與脂代謝重要轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系研究PCR擴增得到miR-26b基因5'側(cè)翼序列1102 bp(包含轉(zhuǎn)錄起始位點上游1018 bp和下游84 bp),對啟動子序列分析發(fā)現(xiàn),miR-26b啟動子上含有四個PPRE、四個SRE位點和兩個LXRE位點,并含有三個典型的Cp G島。激活SREBP1、PPARG和LXRA可顯著上調(diào)miR-26b和CTDSP1的表達水平,并下調(diào)miR-26b啟動子DNA甲基化水平。啟動子熒光素酶活性分析結(jié)果表明,激活SREBP1、PPARG和LXRA可顯著上調(diào)miR-26b啟動子活性。定點突變結(jié)果表明,miR-26b啟動子上PPRE1、PPRE2、SRE1或SRE3位點的突變可導(dǎo)致啟動子活性顯著下降,而LXRE位點的突變對啟動子活性無影響;PPRE1或PPRE2單獨突變均使下調(diào)PPARG對miR-26b啟動子活性的激活作用,而同時突變導(dǎo)致PPARG對miR-26b啟動子活性激活作用消失。SRE1或SRE3單獨突變,導(dǎo)致SREBP1對miR-26b啟動子的激活作用減弱,同時突變SRE1和SRE3,SREBP1對其啟動子活性無激活作用,Ch IP實驗結(jié)果表明,SREBP1蛋白可與miR-26b啟動子上的SRE1和SRE3直接結(jié)合,參與miR-26b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;LXRE突變后,激活LXRA對miR-26b啟動子活性無影響,而突變SRE1或SRE3導(dǎo)致LXRA對miR-26b啟動子活性激活作用減弱,同時突變SRE1和SRE3導(dǎo)致LXRA對miR-26b啟動子活性的激活作用消失。綜上所述,miR-26家族通過多種機制參與細胞內(nèi)甘油三酯合成、脂滴積累及不飽和脂肪酸的合成等生物過程,是反芻動物乳脂代謝的重要調(diào)控因子。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S827

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1 王會;MiR-26家族對奶山羊乳腺脂肪酸代謝的調(diào)控作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

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本文編號：1314223