本文關(guān)鍵詞：褪黑素對(duì)豬卵泡發(fā)育與閉鎖的影響研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：卵泡是哺乳動(dòng)物卵巢的基本結(jié)構(gòu)與功能單元,哺乳動(dòng)物卵巢內(nèi)存在大量處于不同發(fā)育階段的卵泡,但是大部分卵泡在發(fā)育的不同階段會(huì)發(fā)生退化和閉鎖,只有少數(shù)才能發(fā)育成熟以致排卵。卵泡的發(fā)育與閉鎖是一個(gè)受內(nèi)分泌、旁分泌及基因調(diào)節(jié)的復(fù)雜生理過程,研究豬卵泡的發(fā)育與閉鎖對(duì)更好地理解母豬的生殖機(jī)理及進(jìn)一步提高母豬繁殖力均具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。褪黑素主要是由哺乳動(dòng)物松果體產(chǎn)生的一種吲哚胺類激素,是聯(lián)系機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的重要因子之一。研究發(fā)現(xiàn),褪黑素具有較強(qiáng)的氧自由基清除功能,對(duì)人類、豬、牛、綿羊、大鼠、小鼠等物種的生殖機(jī)能具有調(diào)控作用。然而,有關(guān)褪黑素對(duì)豬卵泡閉鎖的影響研究目前尚無系統(tǒng)報(bào)道。本研究探討褪黑素受體基因在母豬不同組織中的表達(dá)規(guī)律,揭示豬不同程度閉鎖有腔卵泡中褪黑素的含量水平,解析內(nèi)源性褪黑素水平與卵泡閉鎖的相關(guān)性,并進(jìn)一步以豬健康有腔卵泡和顆粒細(xì)胞為體外培養(yǎng)模型,探討不同水平褪黑素處理對(duì)體外培養(yǎng)豬有腔卵泡發(fā)育潛能的影響,以及褪黑素影響顆粒細(xì)胞凋亡與類固醇生成的作用途徑,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)褪黑素對(duì)豬卵泡發(fā)育與閉鎖的影響及其分子調(diào)控機(jī)制提供新的依據(jù)。本研究獲得如下結(jié)果:1.成年母豬的腦、肝臟、胰臟、脂肪、卵巢、腎臟、心臟和脾臟等組織中均存在褪黑素受體基因MT1和MT2表達(dá),豬卵巢和腦組織中MT1和MT2的mRNA表達(dá)均顯著高于其它組織(P0.05)。2.褪黑素在豬有腔卵泡中的含量分布呈顯著差異(P0.05),健康卵泡中褪黑素水平最高,早期閉鎖卵泡中次之,晚期閉鎖卵泡中最低。不同程度閉鎖卵泡中顆粒細(xì)胞的凋亡率順序?yàn)?晚期閉鎖卵泡早期閉鎖卵泡健康卵泡。卵泡內(nèi)褪黑素水平與顆粒細(xì)胞凋亡率的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.847,褪黑素水平與卵泡閉鎖存在強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性。健康卵泡顆粒細(xì)胞中褪黑素受體MT1和MT2表達(dá)顯著高于閉鎖卵泡(P0.05),褪黑素及其受體可能在豬卵泡發(fā)育與閉鎖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。3.體外培養(yǎng)直徑3~5 mm的豬健康有腔卵泡,添加不同濃度褪黑素(0,0.05,0.2,0.8 ng/mL)處理6 d,檢測(cè)褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)豬有腔卵泡發(fā)育潛能的影響。結(jié)果揭示,培養(yǎng)48 h后,0.05,0.2和0.8 ng/mL褪黑素處理均提高了卵丘顆粒細(xì)胞層數(shù),其中添加0.8 ng/mL褪黑素組A級(jí)COCs比率(17/48)最高。培養(yǎng)6 d后,褪黑素各處理均顯著提高了卵泡的存活率及卵泡膜完整率,添加0.2 ng/mL褪黑素組卵泡存活率達(dá)95.83%,膜完整性達(dá)72.22%。培養(yǎng)3 d后,0.05 ng/mL褪黑素處理有腔卵泡獲取的卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)散率達(dá)到88.89%,0.2 ng/mL褪黑素處理卵母細(xì)胞極體排出率達(dá)56.94%,顯著高于對(duì)照組(P0.05)。培養(yǎng)3 d后,褪黑素各處理均顯著降低了體外培養(yǎng)有腔卵泡中顆粒細(xì)胞的凋亡率(P0.05)。表明添加0.05,0.2及0.8 ng/mL褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)有腔卵泡的存活、卵丘增殖、卵泡膜完整性維持等均具有促進(jìn)作用,并且能夠顯著抑制顆粒細(xì)胞凋亡。4.分離3~5 mm健康卵泡的顆粒細(xì)胞,添加不同水平褪黑素(0,0.001,0.01,0.1,1.0,10 ng/mL)體外培養(yǎng)48 h后,檢測(cè)褪黑素處理對(duì)體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞增殖凋亡及類固醇生成的影響。結(jié)果表明,添加0.01 ng/mL褪黑素能夠顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的增殖活力及集落形成(P0.01),刺激體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的E2分泌(P0.05),下調(diào)P4水平(P0.05),上調(diào)類固醇合成酶CYP 17A和CYP 19A的表達(dá)(P0.05),抑制顆粒細(xì)胞凋亡(P0.05)。采用0.01 ng/mL褪黑素(MT)或MT聯(lián)用其受體激動(dòng)劑與拮抗劑((MT+IIK-7,MT+Luzindole,MT+4P-PDOT)處理體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞,檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MT及MT+IIK-7處理均能顯著抑制顆粒細(xì)胞凋亡(P0.05),并上調(diào)MT2、Bcl-2、SOD1及GPX4的表達(dá)(P0.05),降低Bax、P53和Caspase-3的表達(dá)(P0.05);與MT處理相比,MT+Luzindole及MT+4P-PDOT處理組顆粒細(xì)胞的凋亡率則明顯上升(P0.05),MT單獨(dú)處理引起的相關(guān)基因表達(dá)變化也被阻斷或消減(P0.05)。表明褪黑素可通過MT2受體激活方式上調(diào)體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞中Bcl-2、GPX4和SOD1表達(dá),下調(diào)Caspase-3、P53和Bax表達(dá),從而抑制顆粒細(xì)胞凋亡。5.體外無血清或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)條件培養(yǎng)豬卵巢顆粒細(xì)胞,添加不同水平褪黑素(0,0.001,0.01,0.1,1.0,10 ng/mL)處理24 h,檢測(cè)褪黑素處理對(duì)顆粒細(xì)胞增殖與凋亡的作用。結(jié)果證明,1.0 ng/mL褪黑素處理顯著抑制了由血清剝奪誘發(fā)的顆粒細(xì)胞凋亡(P0.05),而Luzindole具有抵消褪黑素抗凋亡效應(yīng)的作用(P0.05)。與衣霉素Tun陽(yáng)性處理、血清剝奪處理及空白對(duì)照相比,1.0 ng/mL褪黑素處理及血清剝奪后添加1.0 ng/mL褪黑素處理均顯著抑制了顆粒細(xì)胞凋亡(P0.05)。各處理對(duì)體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞中MT1和FAS表達(dá)無明顯影響(P0.05)。與空白對(duì)照組及MT+Luzindole組相比較,1.0 ng/mL褪黑素處理顯著上調(diào)了MT2表達(dá)(P0.05),抑制了FAS L、CHOP和GRP78的表達(dá)(P0.05);與對(duì)照組相比較,含1.0 ng/mL褪黑素各組SOD1和GPX4表達(dá)水平均顯著升高(P0.05)。褪黑素可通過其受體激活途徑調(diào)控FAS、FSA L、CHOP、GRP78、SOD1和GPX4基因的表達(dá),從而有效抑制體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的凋亡。綜上所述,豬卵泡中褪黑素水平與卵泡閉鎖程度緊密相關(guān),添加適宜水平褪黑素可促進(jìn)體外培養(yǎng)有腔卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育,并能抑制體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的凋亡,調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞類固醇分泌,有差別地調(diào)控死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激應(yīng)答因子及抗氧化酶基因等的表達(dá)。褪黑素可能是通過其直接清除自由基功能發(fā)揮作用的,但同時(shí)也通過膜受體激活途徑發(fā)揮其調(diào)控作用。本研究對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)豬卵泡發(fā)育機(jī)理研究提供新的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S828

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