本文關(guān)鍵詞：楊樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY18、WRKY35和WRKY89在抗病過(guò)程中的功能分析　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：由于固生的生長(zhǎng)方式,植物容易受到各種病原體的侵害,導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,植物發(fā)展出了復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)病原微生物的入侵,其中水楊酸(Salicylic acid,SA)及茉莉酸/乙烯(Jasmonic acid/ethylene,JA/ET)介導(dǎo)的抗病通路是植物兩條主要的抗病途徑。SA信號(hào)通路會(huì)激發(fā)出系統(tǒng)獲得性抗性等免疫反應(yīng),如H2O2積累、病程相關(guān)基因(Pathogenesis-related genes,PR)表達(dá)、細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)等,最終導(dǎo)致植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的抗性增強(qiáng)。另一方面,JA/ET通路參與了植物抵御腐生寄生型病原菌入侵的過(guò)程。同時(shí),SA和JA/ET信號(hào)通路之間也存在相互拮抗的作用,導(dǎo)致植物的抗病機(jī)制更加復(fù)雜。大量證據(jù)表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物抗病方面已被證明具有關(guān)鍵作用。在木本模式植物楊樹(shù)中,已有少量WRKY轉(zhuǎn)錄因子已被克隆并驗(yàn)證了其抗病功能,但關(guān)于WRKY抗病轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此,本研究通過(guò)對(duì)楊樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行全基因組尺度的生物信息學(xué)分析,解析了各成員之間的進(jìn)化關(guān)系,并預(yù)測(cè)了WRKY轉(zhuǎn)錄因子的冗余基因;另一方面通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平分析,初步篩選得到了抗病相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而深入解析了這些基因在楊樹(shù)抗病中的生物學(xué)功能,初步搞清了楊樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在SA抗病信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本論文主要研究結(jié)果如下:1.通過(guò)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)和美國(guó)能源部植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome上毛果楊基因組信息,預(yù)測(cè)得到楊樹(shù)所有WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員�；谶@些轉(zhuǎn)錄因子WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)的不同,將100個(gè)楊樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3個(gè)類(lèi)型(第1族、第2族和第3族)。楊樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析和氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)第2族的成員還可細(xì)分為為IIa、IIb、IIc、IId、IIe五個(gè)亞族和一個(gè)獨(dú)立成員PtrWRKY99。楊樹(shù)WRKY基因在染色體上的定位分析得知,有82個(gè)WRKY基因非隨機(jī)地定位到楊樹(shù)染色體上,并存在明顯的基因冗余現(xiàn)象。楊樹(shù)WRKY蛋白保守氨基酸元件分析發(fā)現(xiàn)在楊樹(shù)WRKY蛋白上存在多種與蛋白質(zhì)功能相關(guān)的氨基酸元件,另外77個(gè)楊樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有核定位信號(hào)(NLS),暗示這些蛋白可能定位于細(xì)胞核。楊樹(shù)wrky基因啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)在這些啟動(dòng)子上分布著大量與環(huán)境脅迫和植物激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件和w盒,推測(cè)其與脅迫應(yīng)答相關(guān),并可能受到自身或者家族其它成員的調(diào)控。rna測(cè)序分析施加sa、茉莉酸甲酯(methyljasmonate,meja)、黑斑病(marssoninabrunnea)、機(jī)械損傷、鹽處理和冷處理等處理的野生型毛白楊中wrky基因的表達(dá)水平,結(jié)果顯示61%的基因表達(dá)會(huì)受到至少一種處理的影響。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在葉片中有較高表達(dá)的18個(gè)wrky基因?qū)αN處理的應(yīng)答有很大差異,其中ptrwrky60和ptrwrky89特異地受sa誘導(dǎo)。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)ptrwrky89為楊樹(shù)wrky家族第3族成員,ptrwrky54和ptrwrky62是其同源基因,暗示了在楊樹(shù)中ptrwrky89,ptrwrky54和ptrwrky62存在功能冗余。在擬南芥中,ptrwrky89和atwrky70的同源性最高。通過(guò)啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn),ptrwrky89特異地在老葉中表達(dá),而在嫩葉中的表達(dá)量極低。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)和酵母轉(zhuǎn)錄自激活實(shí)驗(yàn)表明ptrwrky89是特異定位在細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄激活子。過(guò)量表達(dá)ptrwrky89的擬南芥與野生型擬南芥在在植株大小上無(wú)明顯差異。通過(guò)接種丁香假單胞菌(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000,pstdc3000)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的褪綠速度明顯快于野生型,總?cè)~綠素的含量相比于野生型更低,葉肉中的細(xì)菌數(shù)目也顯著多余野生型植株,這些結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)ptrwrky89的擬南芥對(duì)pstdc3000的抗性明顯低于野生型擬南芥,因此ptrwrky89可以降低擬南芥對(duì)pstdc3000的抗性。另外一方面,對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥接種葡萄孢菌(botrytiscinerea)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片上的壞死面積明顯大于野生型擬南芥,而b.cinerea在植株上的生長(zhǎng)情況也反映轉(zhuǎn)基因植株對(duì)b.cinerea的抗性明顯低于野生型擬南芥,表明過(guò)量表達(dá)ptrwrky89會(huì)降低擬南芥對(duì)b.cinerea的抗性。通過(guò)熒光定量pcr分析過(guò)量表達(dá)ptrwrky89和野生型擬南芥中sa和ja介導(dǎo)的信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)標(biāo)志基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因株系中都顯著低于野生型擬南芥,表明在轉(zhuǎn)基因株系中,sa和ja信號(hào)通路都遭到削弱。在楊樹(shù)中,用楊樹(shù)潰瘍病(dothiorellagregaria)接種過(guò)量表達(dá)ptrwrky89的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)和野生型毛白楊,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)葉片上的壞死斑面積顯著小于野生型毛白楊,表明轉(zhuǎn)基因毛白楊對(duì)潰瘍病的抗性顯著增強(qiáng)。通過(guò)半定量pcr分析楊樹(shù)中sa信號(hào)通路相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)sa信號(hào)的標(biāo)志基因pr的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中顯著高于野生型毛白楊,表明ptrwrky89正向調(diào)控了楊樹(shù)sa信號(hào)通路。另外,在過(guò)量表達(dá)ptrwrky89的毛白楊中,ptowrky18和ptowrky35的表達(dá)量相對(duì)于野生型也有明顯上調(diào),暗示了這兩個(gè)基因可能參與調(diào)控了楊樹(shù)sa信號(hào)通路,并可能受到ptrwrky89的調(diào)控。進(jìn)一步分析啟動(dòng)子元件表明在ptrwrky18和PtrWRKY35的啟動(dòng)子上存在W盒,通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證明PtrWRKY89可以直接結(jié)合這些W盒,因此Ptr WRKY18和PtrWRKY35是PtrWRKY89的靶基因。2.氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),PtrWRKY18和PtrWRKY35是楊樹(shù)IIa亞族的一對(duì)同源蛋白,都與擬南芥AtWRKY18關(guān)系較近,在蛋白的N端存在一個(gè)假定的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn),PtrWRKY18主要在楊樹(shù)幼葉的葉脈和幼嫩的莖部表達(dá),而PtrWRKY35在楊樹(shù)中的表達(dá)量十分微弱,在擬南芥中,Ptr WRKY18和PtrWRKY35的啟動(dòng)子受到SA和病原微生物的誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)和酵母自激活實(shí)驗(yàn)表明PtrWRKY18和PtrWRKY35特異定位于細(xì)胞核,且無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性。酵母雙雜交表明PtrWRKY18和PtrWRKY35的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)與AtWRKY18的不同,不能介導(dǎo)PtrWRKY18和PtrWRKY35形成同源或異源二聚體。在擬南芥中分別過(guò)量表達(dá)PtrWRKY18和PtrWRKY35會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)Pst DC3000的抗性降低而對(duì)B.cinerea的抗性增強(qiáng)。進(jìn)一步檢測(cè)擬南芥中SA和JA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)SA信號(hào)通路減弱而JA信號(hào)通路增強(qiáng)。在楊樹(shù)中,過(guò)量表達(dá)PtrWRKY18或PtrWRKY35都會(huì)提高轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)對(duì)楊樹(shù)葉銹病(Melampsora medusae)的抗性,而兩基因的突變體楊樹(shù)對(duì)葉銹病的抗性與野生型相比并無(wú)明顯差異。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Ptr WRKY18和PtrWRKY35過(guò)量表達(dá)楊樹(shù)中PR基因的表達(dá)量明顯提高,而突變體楊樹(shù)與野生型相比無(wú)顯著差異。綜上所述,通過(guò)對(duì)楊樹(shù)WRKY基因家族的生物信息學(xué)分析,篩選得到受SA誘導(dǎo)的PtrWRKY89,并證明PtrWRKY89可以通過(guò)直接控制PtrWRKY18和PtrWRKY35的表達(dá)正向調(diào)控楊樹(shù)SA信號(hào)通路,從而增強(qiáng)楊樹(shù)的抗病性。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2;S763.7
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本文編號(hào)：1311948