本文關(guān)鍵詞：楊樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY18、WRKY35和WRKY89在抗病過程中的功能分析　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：由于固生的生長方式,植物容易受到各種病原體的侵害,導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。在長期的進(jìn)化過程中,植物發(fā)展出了復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來應(yīng)對病原微生物的入侵,其中水楊酸(Salicylic acid,SA)及茉莉酸/乙烯(Jasmonic acid/ethylene,JA/ET)介導(dǎo)的抗病通路是植物兩條主要的抗病途徑。SA信號通路會激發(fā)出系統(tǒng)獲得性抗性等免疫反應(yīng),如H2O2積累、病程相關(guān)基因(Pathogenesis-related genes,PR)表達(dá)、細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)等,最終導(dǎo)致植物對活體營養(yǎng)型病原菌的抗性增強(qiáng)。另一方面,JA/ET通路參與了植物抵御腐生寄生型病原菌入侵的過程。同時,SA和JA/ET信號通路之間也存在相互拮抗的作用,導(dǎo)致植物的抗病機(jī)制更加復(fù)雜。大量證據(jù)表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物抗病方面已被證明具有關(guān)鍵作用。在木本模式植物楊樹中,已有少量WRKY轉(zhuǎn)錄因子已被克隆并驗(yàn)證了其抗病功能,但關(guān)于WRKY抗病轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究尚未見報道。為此,本研究通過對楊樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行全基因組尺度的生物信息學(xué)分析,解析了各成員之間的進(jìn)化關(guān)系,并預(yù)測了WRKY轉(zhuǎn)錄因子的冗余基因;另一方面通過轉(zhuǎn)錄水平分析,初步篩選得到了抗病相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而深入解析了這些基因在楊樹抗病中的生物學(xué)功能,初步搞清了楊樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子在SA抗病信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本論文主要研究結(jié)果如下:1.通過植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫和美國能源部植物基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome上毛果楊基因組信息,預(yù)測得到楊樹所有WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員�；谶@些轉(zhuǎn)錄因子WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)的不同,將100個楊樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3個類型(第1族、第2族和第3族)。楊樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)發(fā)生樹分析和氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)第2族的成員還可細(xì)分為為IIa、IIb、IIc、IId、IIe五個亞族和一個獨(dú)立成員PtrWRKY99。楊樹WRKY基因在染色體上的定位分析得知,有82個WRKY基因非隨機(jī)地定位到楊樹染色體上,并存在明顯的基因冗余現(xiàn)象。楊樹WRKY蛋白保守氨基酸元件分析發(fā)現(xiàn)在楊樹WRKY蛋白上存在多種與蛋白質(zhì)功能相關(guān)的氨基酸元件,另外77個楊樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有核定位信號(NLS),暗示這些蛋白可能定位于細(xì)胞核。楊樹wrky基因啟動子分析發(fā)現(xiàn)在這些啟動子上分布著大量與環(huán)境脅迫和植物激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件和w盒,推測其與脅迫應(yīng)答相關(guān),并可能受到自身或者家族其它成員的調(diào)控。rna測序分析施加sa、茉莉酸甲酯(methyljasmonate,meja)、黑斑病(marssoninabrunnea)、機(jī)械損傷、鹽處理和冷處理等處理的野生型毛白楊中wrky基因的表達(dá)水平,結(jié)果顯示61%的基因表達(dá)會受到至少一種處理的影響。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在葉片中有較高表達(dá)的18個wrky基因?qū)αN處理的應(yīng)答有很大差異,其中ptrwrky60和ptrwrky89特異地受sa誘導(dǎo)。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)ptrwrky89為楊樹wrky家族第3族成員,ptrwrky54和ptrwrky62是其同源基因,暗示了在楊樹中ptrwrky89,ptrwrky54和ptrwrky62存在功能冗余。在擬南芥中,ptrwrky89和atwrky70的同源性最高。通過啟動子分析發(fā)現(xiàn),ptrwrky89特異地在老葉中表達(dá),而在嫩葉中的表達(dá)量極低。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)和酵母轉(zhuǎn)錄自激活實(shí)驗(yàn)表明ptrwrky89是特異定位在細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄激活子。過量表達(dá)ptrwrky89的擬南芥與野生型擬南芥在在植株大小上無明顯差異。通過接種丁香假單胞菌(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000,pstdc3000)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的褪綠速度明顯快于野生型,總?cè)~綠素的含量相比于野生型更低,葉肉中的細(xì)菌數(shù)目也顯著多余野生型植株,這些結(jié)果表明過量表達(dá)ptrwrky89的擬南芥對pstdc3000的抗性明顯低于野生型擬南芥,因此ptrwrky89可以降低擬南芥對pstdc3000的抗性。另外一方面,對轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥接種葡萄孢菌(botrytiscinerea)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片上的壞死面積明顯大于野生型擬南芥,而b.cinerea在植株上的生長情況也反映轉(zhuǎn)基因植株對b.cinerea的抗性明顯低于野生型擬南芥,表明過量表達(dá)ptrwrky89會降低擬南芥對b.cinerea的抗性。通過熒光定量pcr分析過量表達(dá)ptrwrky89和野生型擬南芥中sa和ja介導(dǎo)的信號通路相關(guān)基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)標(biāo)志基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因株系中都顯著低于野生型擬南芥,表明在轉(zhuǎn)基因株系中,sa和ja信號通路都遭到削弱。在楊樹中,用楊樹潰瘍病(dothiorellagregaria)接種過量表達(dá)ptrwrky89的轉(zhuǎn)基因楊樹和野生型毛白楊,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因楊樹葉片上的壞死斑面積顯著小于野生型毛白楊,表明轉(zhuǎn)基因毛白楊對潰瘍病的抗性顯著增強(qiáng)。通過半定量pcr分析楊樹中sa信號通路相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)sa信號的標(biāo)志基因pr的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因楊樹中顯著高于野生型毛白楊,表明ptrwrky89正向調(diào)控了楊樹sa信號通路。另外,在過量表達(dá)ptrwrky89的毛白楊中,ptowrky18和ptowrky35的表達(dá)量相對于野生型也有明顯上調(diào),暗示了這兩個基因可能參與調(diào)控了楊樹sa信號通路,并可能受到ptrwrky89的調(diào)控。進(jìn)一步分析啟動子元件表明在ptrwrky18和PtrWRKY35的啟動子上存在W盒,通過酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證明PtrWRKY89可以直接結(jié)合這些W盒,因此Ptr WRKY18和PtrWRKY35是PtrWRKY89的靶基因。2.氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),PtrWRKY18和PtrWRKY35是楊樹IIa亞族的一對同源蛋白,都與擬南芥AtWRKY18關(guān)系較近,在蛋白的N端存在一個假定的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。啟動子分析發(fā)現(xiàn),PtrWRKY18主要在楊樹幼葉的葉脈和幼嫩的莖部表達(dá),而PtrWRKY35在楊樹中的表達(dá)量十分微弱,在擬南芥中,Ptr WRKY18和PtrWRKY35的啟動子受到SA和病原微生物的誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)和酵母自激活實(shí)驗(yàn)表明PtrWRKY18和PtrWRKY35特異定位于細(xì)胞核,且無轉(zhuǎn)錄激活活性。酵母雙雜交表明PtrWRKY18和PtrWRKY35的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)與AtWRKY18的不同,不能介導(dǎo)PtrWRKY18和PtrWRKY35形成同源或異源二聚體。在擬南芥中分別過量表達(dá)PtrWRKY18和PtrWRKY35會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥對Pst DC3000的抗性降低而對B.cinerea的抗性增強(qiáng)。進(jìn)一步檢測擬南芥中SA和JA信號通路相關(guān)基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)SA信號通路減弱而JA信號通路增強(qiáng)。在楊樹中,過量表達(dá)PtrWRKY18或PtrWRKY35都會提高轉(zhuǎn)基因楊樹對楊樹葉銹病(Melampsora medusae)的抗性,而兩基因的突變體楊樹對葉銹病的抗性與野生型相比并無明顯差異。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Ptr WRKY18和PtrWRKY35過量表達(dá)楊樹中PR基因的表達(dá)量明顯提高,而突變體楊樹與野生型相比無顯著差異。綜上所述,通過對楊樹WRKY基因家族的生物信息學(xué)分析,篩選得到受SA誘導(dǎo)的PtrWRKY89,并證明PtrWRKY89可以通過直接控制PtrWRKY18和PtrWRKY35的表達(dá)正向調(diào)控楊樹SA信號通路,從而增強(qiáng)楊樹的抗病性。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S763.7
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本文編號：1311948