發(fā)布時(shí)間：2017-12-20 01:12

  本文關(guān)鍵詞：禽白血病病毒和柔嫩艾美耳球蟲共感染致病機(jī)制研究　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：禽白血病(Avian Leukosis,AL)是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒(ALV)引起的雞的各種可傳播的良性和惡性腫瘤。ALV主要侵害宿主的免疫細(xì)胞,造成雞體免疫抑制,造成其他病原繼發(fā)感染。J亞群是90年代初從肉雞中分離到的ALV,現(xiàn)在已經(jīng)迅速蔓延到很多國(guó)家,我國(guó)關(guān)于ALV感染的報(bào)道也很多,給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來,被命名為K亞群的ALV陸續(xù)從中國(guó)的不同地方品系雞群中分離出,但這些中國(guó)分離株的致病性仍有待進(jìn)一步研究。雞球蟲病是一類由專性細(xì)胞內(nèi)寄生的艾美耳屬原蟲引起的雞腸道原蟲疾病。艾美耳屬入侵宿主腸上皮細(xì)胞,損害腸道的完整性和腸粘膜免疫,所以感染雞經(jīng)常存在與腸道內(nèi)的其他寄生蟲、細(xì)菌以及各種病毒的共感染現(xiàn)象。E.tenella是其中致病性最強(qiáng)的蟲種之一,主要寄生在盲腸上皮細(xì)胞內(nèi)。球蟲在環(huán)境中無處不在,高達(dá)90%的雞群中有球蟲的存在,并且有大量雞感染球蟲。如果該病原的感染未能有效控制,往往造成高死亡率。雞群中不同病原(細(xì)菌、病毒、或是寄生蟲)共感染的現(xiàn)象十分普遍,尤其是在發(fā)病雞群中病原共感染的比例很高,這往往導(dǎo)致它們對(duì)雞體的致病性增強(qiáng)。病原共感染的現(xiàn)象對(duì)于疾病的診斷和防控是個(gè)極大的挑戰(zhàn)。鑒于ALV和球蟲都是雞群中常見的病原,對(duì)感染雞都造成免疫損傷,同時(shí)都存在與其他病原共感染的現(xiàn)象,關(guān)于這兩種病原共感染的現(xiàn)象未見報(bào)道,本課題開展對(duì)ALV和雞球蟲的共感染研究,分析它們共感染的現(xiàn)狀和致病性,并試圖通過高通量技術(shù)闡明不同病原共感染致病調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。腸道微生物區(qū)系十分復(fù)雜,含有豐富多樣的菌群,腸道微生物基因組被譽(yù)為宿主的“第二基因組”。腸道菌群不僅在機(jī)體的消化、吸收和營(yíng)養(yǎng)方面發(fā)揮重要作用,還能夠刺激腸道上皮細(xì)胞發(fā)育,幫助塑造腸道免疫功能,各種生理和心理健康問題也與腸道菌群的紊亂有關(guān),所以近年來腸道菌群的功能越來越受到科研工作者的重視。雞盲腸是雞體內(nèi)微生物區(qū)系最復(fù)雜的器官,1克(g)盲腸內(nèi)容物(濕重)大約含有1011的細(xì)菌,其中包括很多條件致病菌,當(dāng)雞體免疫功能改變后,這些條件致病菌為繼發(fā)感染提供了大量的資源。通過宏基因組學(xué)直接抽提樣本中的宏基因組進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析,相比傳統(tǒng)的依賴于培養(yǎng)的方法能夠同時(shí)檢測(cè)腸道內(nèi)整體的菌群分布。通過高通量技術(shù)解析病原感染后腸道菌群的變化可能有助于我們闡明病原的致病機(jī)制。后基因組時(shí)代,蛋白質(zhì)作為生物功能的執(zhí)行者已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)機(jī)體器官、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、蛋白修飾、蛋白之間的相互作用與功能等進(jìn)行高通量篩選和分析,比傳統(tǒng)的單個(gè)蛋白的研究更能準(zhǔn)確反映機(jī)體的整體狀態(tài)。因此作為一種全新的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為篩選病原感染中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用的差異蛋白,并進(jìn)一步揭示致病機(jī)理提供了強(qiáng)有力的幫助。1.雞群中alv和球蟲共感染現(xiàn)狀的流行病學(xué)調(diào)查本研究通過病原學(xué)檢測(cè)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行雞群中alv和球蟲共感染現(xiàn)狀的流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果顯示,在我們調(diào)查的范圍內(nèi)(山東濟(jì)寧、泰安肥城和新泰),所有地區(qū)的大部分雞場(chǎng)樣品都檢出球蟲,個(gè)別雞場(chǎng)的樣品球蟲檢出率高達(dá)90%,而只有來源于泰安肥城不同雞場(chǎng)的樣品檢出alv,陽性率高達(dá)33.3%,擴(kuò)增gp85序列測(cè)序發(fā)現(xiàn)均為alv-j感染。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)泰安市肥城地區(qū)alv和雞球蟲共感染的比例達(dá)13.33%。本研究首次證實(shí)雞群中確實(shí)存在alv和球蟲共感染的現(xiàn)象。2.alv分離株js11c1的全基因組測(cè)序、傳染性克隆構(gòu)建及其生物學(xué)活性分析將中國(guó)地方品種雞alv分離株js11c1的全基因組測(cè)序,構(gòu)建其傳染性克隆,并將它的全基因組序列和部分作用元件與genbank中已經(jīng)發(fā)表的其它的alv進(jìn)行比較。結(jié)果顯示js11c1基因組全長(zhǎng)7707bp,基因組結(jié)構(gòu)屬于典型的復(fù)制完整型的c型反轉(zhuǎn)錄病毒,不含有腫瘤基因。傳染性克隆拯救出的病毒復(fù)制能力和生物學(xué)活性與母本病毒一致�；谡麄�(gè)基因組的序列比較結(jié)果進(jìn)一步確定js11c1及其它幾個(gè)alv毒株與其它已知的亞群同源性比較低,可以分類為一個(gè)新的亞群k。本研究基于js11c1整個(gè)基因組序列與已知alv六個(gè)亞群的同源性比較,為k亞群的建立提供了分子依據(jù),并從基因組水平進(jìn)一步確立了它的分類地位;首次構(gòu)建了該類alvs的傳染性克隆,為進(jìn)一步進(jìn)行這類病毒的體外生物學(xué)活性研究、基因組結(jié)構(gòu)和功能以及致病的分子機(jī)制提供平臺(tái)。3.不同亞群alv與e.tenella共感染對(duì)不同品種雞的致病性分析本研究進(jìn)行不同亞群alv(j:rnx0101和k:rjs11c1)與e.tenella共感染對(duì)不同品種雞(spf雞、海蘭褐蛋雞和aa肉雞)的致病性分析。結(jié)果顯示不同亞群alv分別和e.tenella共感染后不同品種雞死亡率都明顯增加,雞體重減輕。alv感染加快球蟲疾病病程,e.tenella感染延長(zhǎng)alv感染雞的病毒血癥。與單一病原感染雞和健康雞相比,共感染雞胸腺萎縮、對(duì)感染病原和ndv滅活苗的體液免疫水平降低、外周血中淋巴細(xì)胞亞群以及全身和局部細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平紊亂。結(jié)果表明不同亞群alv與e.tenella共感染在對(duì)不同品種雞的致病性都具有一定的協(xié)同作用。4.alv和e.tenella共感染對(duì)雞盲腸菌群的影響通過分析alv和e.tenella感染后雞盲腸菌群的變化揭示不同病原感染及共感染的致病機(jī)制。ALV感染均引起盲腸菌群多樣性增加,共生菌的大量缺失,很多條件致病菌顯著富集,不同亞群ALV感染引起不同條件致病菌的富集。E.tenella感染對(duì)雞盲腸菌群最顯著的影響是造成盲腸腸道菌群結(jié)構(gòu)極大程度的改變,多樣性和豐富度急劇降低,與ALV感染類似,大部分常駐菌急劇缺失,同時(shí)引起大量條件致病菌的顯著富集。r-NX0101和E.tenella共感染的雞體內(nèi)盲腸菌群呈現(xiàn)多元性變化,感染情況介于球蟲單獨(dú)感染和AJ感染之間,并且造成某些菌在個(gè)體中的增殖;而r-JS11C1和E.tenella共感染有明顯的協(xié)同作用,尤其是對(duì)一些條件致病菌的進(jìn)一步富集,導(dǎo)致雞體繼發(fā)細(xì)菌感染的幾率增加,這可能與共感染致病性增加有關(guān)。5.不同亞群ALV與E.tenella共感染對(duì)雞脾臟蛋白組的影響利用iTRAQ技術(shù)對(duì)不同亞群ALV分別和E.tenella共感染雞脾臟以及健康雞脾臟蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究,共鑒定蛋白質(zhì)1737個(gè)。對(duì)鑒定的脾臟蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能注釋發(fā)現(xiàn)大部分蛋白參與基本的生物學(xué)代謝過程,并且有很多蛋白參與免疫相關(guān)的生物過程,注釋到不同的病原感染和各種疾病相關(guān)的通路中。其中r-NX0101感染主要影響了宿主的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾等相關(guān)的功能,以及與腫瘤形成與遷移密切相關(guān)的基質(zhì)粘附蛋白的表達(dá),這些差異蛋白可能與J亞群ALV的致腫瘤特性密切相關(guān);r-JS11C1感染主要是富集翻譯后修飾相關(guān)的宿主功能蛋白;E.tenella感染主要是由于其蟲體入侵影響宿主的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu);r-NX0101和E.tenella共感染則對(duì)具有細(xì)胞溶解功能蛋白的富集最為顯著,并且還有一些差異蛋白參與到重要的免疫學(xué)相關(guān)的代謝通路;而r-JS11C1和E.tenella共感染則主要影響應(yīng)激和神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)蛋白的表達(dá)。這將為闡明共感染致病機(jī)理提供新思路和理論依據(jù),增加我們對(duì)病原與宿主相互作用的認(rèn)識(shí)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31
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本文編號(hào)：1310180