本文關(guān)鍵詞：中華鱉腸道粘膜免疫細(xì)胞分子機(jī)理及口服納米疫苗的研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：中華鱉(Pelodiscrus sinensis),俗稱甲魚,是我國傳統(tǒng)的淡水養(yǎng)殖品種。近幾年來,由于養(yǎng)殖密度增加、養(yǎng)殖環(huán)境日益惡劣,中華鱉在養(yǎng)殖過程中遭受了各類病原微生物的侵害。這些病原微生物往往能引起養(yǎng)殖物種的大量死亡,給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前主要采用化學(xué)藥物防治疾病,而化學(xué)藥物的不規(guī)范使用會帶來較大的食品安全隱患,并危害生態(tài)環(huán)境。免疫防治作為一種更加安全環(huán)保的防控手段,開始逐漸成為研究熱點。腸道是動物重要的免疫器官,是機(jī)體抵抗外源微生物的第一道防線。研究中華鱉的腸道粘膜免疫系統(tǒng),有助于更好地了解中華鱉的免疫防御機(jī)制,并為制作口服納米疫苗提供理論基礎(chǔ)。研究中我們采用組織學(xué)、分子生物學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法系統(tǒng)研究了中華鱉腸道粘膜免疫系統(tǒng),確定了腸道主要的免疫細(xì)胞,揭示了腸道對外源刺激物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的的分子機(jī)制,分析了參與粘膜免疫的重要蛋白多聚免疫球蛋白受體的免疫應(yīng)答反應(yīng),并在以上免疫機(jī)理的基礎(chǔ)上,研制了一種運載病原菌外膜蛋白的納米口服疫苗,并檢測了其對中華鱉的免疫應(yīng)答反應(yīng)。具體研究結(jié)果如下:1.中華鱉腸道粘膜免疫相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和研究利用透射電子顯微鏡觀察了中華鱉腸道橫切面,發(fā)現(xiàn)腸道存在著大量的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。將外源溫和氣單胞菌和LPS誘導(dǎo)中華鱉,利用HE染色和PAS染色方法分別觀察和統(tǒng)計腸道絨毛上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)目變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該兩種免疫細(xì)胞數(shù)目在腸道前段、中段和后段,均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢,且在48 h數(shù)目達(dá)到最大值,顯著高于生理鹽水對照組(P0.05)。同時我們還利用熒光定量PCR技術(shù)來檢測外源誘導(dǎo)物L(fēng)PS和溫和氣單胞菌對腸道免疫球蛋白IgM和IgD的基因表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgM基因表達(dá)量上升,而IgD基因的表達(dá)量變化不明顯。2.轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究中華鱉腸道粘膜免疫機(jī)制利用組織切片及轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)深入分析外源LPS誘導(dǎo)中華鱉腸道的免疫應(yīng)答機(jī)制。結(jié)果顯示,LPS刺激48h后,腸道的免疫相關(guān)細(xì)胞杯狀細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著上升,說明外源LPS引起了腸道免疫應(yīng)答。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),發(fā)現(xiàn)外源LPS誘導(dǎo)組和生理鹽水對照組之間存在著748個差異表達(dá)基因,包括361個表達(dá)量上調(diào)的基因和387個表達(dá)量下調(diào)的基因,其中有48個基因被鑒定與免疫相關(guān),這些基因?qū)儆?2個GO terms和14個途徑。3.中華鱉pIgR基因的克隆及其對外源刺激的免疫應(yīng)答通過氨基酸結(jié)構(gòu)以及同源性分析,發(fā)現(xiàn)中華鱉pIgR基因能夠編碼591個氨基酸,蛋白分子量和等電點分別為65.7 kDa和7.38,包含有胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū),其中胞外區(qū)包括了四個結(jié)構(gòu)域;pIgR與其他爬行動物的同源性較高,鳥類、哺乳類和兩棲類次之,而與魚類的同源性最低。通過熒光定量PCR,顯示pIgR基因在各組織器官中的表達(dá)量從高到低依次為:小腸、食道、大腸、肝臟、心臟、肌肉、脾臟、胃和腎臟;在胚胎發(fā)育過程中,該基因的表達(dá)量呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢,在孵化31 d時達(dá)到最大值。受到外源刺激物溫和氣單胞菌和LPS誘導(dǎo)后,pIgRmRNA的表達(dá)量在食道、胃、小腸和大腸中均有顯著上調(diào)后又逐漸恢復(fù)正常水平的變化趨勢。Western blotting和免疫組化結(jié)果顯示,pIgR蛋白在腸上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),且小腸組織pIgR蛋白表達(dá)會隨著LPS誘導(dǎo)上調(diào),說明該蛋白在中華鱉粘膜免疫中具有重要作用。4.中華鱉口服納米疫苗及免疫效果的研究利用離子交換法制備得到一種羧甲基殼聚糖納米顆粒,羧甲基殼聚糖和CaC12的最佳配比為:0.5mg/mL與2mg/mL,制備得到的納米顆粒平均粒徑為229.07±4.28nm,多分散系數(shù)PDI僅為0.070±0.02,顆粒粒徑小、分散性好、顆粒均一,具有較好的安全性、穩(wěn)定性以及對腸道的通透性。從嗜水氣單胞菌中提取主要蛋白大小為43 kDa和38 kDa的外膜蛋白,利用羧甲基殼聚糖納米粒包埋該蛋白制備得到一種納米口服疫苗,以生理鹽水、羧甲基殼聚糖納米粒以及外膜蛋白作為對照,通過組織化學(xué)和熒光定量PCR技術(shù)來檢驗口服納米疫苗的免疫效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米疫苗的免疫效果高于外膜蛋白和羧甲基殼聚糖,且二次強(qiáng)化免疫也能引起機(jī)體腸道的免疫反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S947.1

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本文編號：1308833