本文關(guān)鍵詞：桑樹雌花形成中乙烯作用機(jī)制的研究　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：花性調(diào)控的研究一直以來是生物學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn),果桑,葉用桑,生態(tài)桑等不同用途品種的開發(fā)對桑樹花性別要求不同。桑樹種質(zhì)資源研究的傳統(tǒng)方法為通過雜交育種篩選出優(yōu)良性狀,然后通過無性繁殖(扦插或嫁接)的方式增加群體數(shù)量。雜交育種存在周期長,效率低的缺點(diǎn),對于不同需求品種的開發(fā),如果能通過分子學(xué)手段在植株生長早期鑒定到其性別,將縮短育種周期,避免育種與生產(chǎn)中的浪費(fèi)。因此,對桑樹花性調(diào)控的研究具有極大地理論價值和經(jīng)濟(jì)價值。乙烯是一種重要的氣體植物激素,參與調(diào)節(jié)多種植物生長、發(fā)育過程,并能響應(yīng)多種外部信號,如種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育、果實成熟、葉片衰老、花性分化和抵抗生物與非生物脅迫等。乙烯作為植物的性別激素調(diào)控花器官性別分化,黃瓜的兩個性別決定基因(F、M)經(jīng)鑒定為乙烯合成的限速酶ACS家族的基因。桑樹花性分雌花、雄花、雌雄同花、雌雄同穗等,根據(jù)每株樹開花的不同又分為雌雄同株,雌雄異株。桑樹花性的主要決定因素是遺傳因子。另外桑樹花性也受到激素、環(huán)境等因素的影響。偏雄性的植株在噴施乙烯利后,出現(xiàn)了更多的雌花,而使雄花減少。赤霉素與乙烯利作用相反。構(gòu)建桑樹花芽性別分化時期的基因連續(xù)表達(dá)譜,將有助于研究乙烯與雌花發(fā)育的關(guān)系,并為篩選性別決定基因,構(gòu)建同基因型雌雄異株育種材料等提供豐富的研究數(shù)據(jù),加快桑樹育種速度。本研究首先通過生物信息學(xué)的方法鑒定了桑樹中乙烯合成與信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因,結(jié)合多種軟件分析了其基因結(jié)構(gòu),保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。進(jìn)一步檢測其在六個不同組織(根、皮、葉、雄花、雌花、果)中的表達(dá)模式。我們還鑒定了響應(yīng)乙烯信號的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的基因,分析了其序列信息及在多種組織中的表達(dá)情況。隨后我們選取了開雌花的珍珠白作為實驗材料,用石蠟切片的方法確定了其花芽發(fā)育時期形態(tài)變化,從中選擇包括花性分化時期的6個樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,對測序結(jié)果進(jìn)行了差異基因分析,KEGG功能富集分析,聚類分析,并重點(diǎn)選取激素相關(guān)基因、AP2/ERF家族基因和MADS-box家族基因進(jìn)行了表達(dá)分析,隨后選取特異表達(dá)基因進(jìn)行了共表達(dá)分析。通過原位雜交的方法研究了乙烯合成關(guān)鍵基因在花芽中的表達(dá)位置。通過乙烯利(分解生成乙烯)和AVG(抑制乙烯的合成)兩種藥物處理珍珠白花芽檢測了AP2/ERF家族基因表達(dá)的變化。最后構(gòu)建了4個AP2/ERF轉(zhuǎn)基因過表達(dá)載體,在煙草中驗證其功能。本研究所獲得研究結(jié)果如下：1、桑樹乙烯合成與信號傳導(dǎo)相關(guān)基因鑒定及生物信息學(xué)分析結(jié)合使用blast與HMM search兩種方法在川桑基因組中共鑒定到29個乙烯合成與信號傳導(dǎo)相關(guān)基因及116個AP2/ERF家族基因。基因位置顯示MnEIN3. MnEILI和MnEIL4、MnEIL5分別都定位在桑樹基因組的同一個scaffold上。對四個較重要家族(ACS、ACO、ETR、EIN3)的基因進(jìn)行了克隆驗證�；蚪Y(jié)構(gòu)預(yù)測顯示桑樹中這四個基因家族,除了MnEIL4外,其他基因與以往研究的同源基因具有一致的基因結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域分析顯示MnACS5由于C末端缺失,缺乏相應(yīng)的磷酸化位點(diǎn),其他MnACS家族基因都含有保守的功能基序。MnACO家族基因都含有保守的功能基序。ETR家族中MnEIN4在N端含有一個信號肽結(jié)構(gòu),MnERS1蛋白C末端相對其他成員較短,導(dǎo)致其缺失一個信號接收結(jié)構(gòu)域。MnEIN3家族中,除保守的結(jié)構(gòu)域外,MnEIN3和MnEIL1還含有在綠豆基因中發(fā)現(xiàn)的兩個保守的富含谷氨酸和天冬氨酸的區(qū)域。檢測這四個基因家族在六個桑樹組織(根、皮、葉、雄花、雌花、果)中的表達(dá)發(fā)現(xiàn),基因表達(dá)模式多樣,同時有一些組織特異表達(dá)的基因,其中MnACS5在雌花中特異表達(dá)。MnACO1和MnACD2在果實中特異表達(dá)。MnEIN3和MnEIL1在根和果中顯示更高的表達(dá)。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)乙烯信號,按結(jié)構(gòu)分為5個亞家族。各亞家族基因數(shù)目為ERF(58)、DREB(33)、AP2(21)、RAV(3)、Soloist(1)。按系統(tǒng)發(fā)生樹分析又分為15個群。DREB亞家族包括(Ⅰ-Ⅳ)群,ERF亞家族包括(Ⅴ-Ⅹ)群。其中V群基因中,桑樹有11個成員,而擬南芥中僅含有5個成員。檢測含有EAR(DLNXXP、 LXLXL、LDLNLXPP)基序的基因顯示,含LXLXL基序的基因數(shù)目最多,另外MnERF亞家族含EAR基序的基因主要集中在MnERF-B 1亞群�；虮磉_(dá)模式表明其有不同的表達(dá)模式。其中MnERF-B3-21在雄花中特異表達(dá),MnDERB-A4-7在葉中更豐富,MnAP2-5在雄花中有高水平表達(dá),另外有9個基因在任何組織中都沒有檢測到表達(dá),推測這些基因響應(yīng)某種特殊的外界刺激或內(nèi)部環(huán)境信號。2、桑樹早期花芽發(fā)育形態(tài)變化及轉(zhuǎn)錄組分析選取僅開雌花的珍珠白做為實驗材料,通過石蠟切片技術(shù)觀察其花芽發(fā)育時期的形態(tài)變化,選取其中包括花性分化時期的6個花芽樣本(flwoer bud,FB)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,分別命名為FB1-FB6。測序結(jié)果顯示共得到118584個contigs與87719個unigenes。其中unigenes的平均長度為727 bp,中間長度為381bp,最大長度為16738 bp,N50和N90分別為1307 bp和282bp。功能注釋結(jié)果顯示有45.44%的基因可以至少在一個數(shù)據(jù)庫中得到注釋,其中在Nr庫中得到注釋的基因最多(39.64%),僅有6.78%的基因在所有數(shù)據(jù)庫中都能得到注釋。通過blast和estscan分別得到35536(40.5%)條和26726(30.4%)條可編碼蛋白質(zhì)的序列。我們采取兩種方式尋找差異基因。第一種為相鄰時間點(diǎn)間差異表達(dá)基因,數(shù)目為808個。第二種為其他時間點(diǎn)與FB1之間差異表達(dá)基因,數(shù)目為1037個。所有差異基因一起聚類分析顯示大多數(shù)差異基因在FB2和FB3上調(diào),隨后被下調(diào)表達(dá)。差異基因KEGG富集分析顯示FB1與FB2之間的差異基因顯著富集在植物激素信號途徑、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、α-亞麻酸代謝、磷酸肌醇代謝和類黃酮合成五個途徑。而在FB3和FB4之間的差異基因同樣富集在除類黃酮合成之外的四個途徑。植物激素信號途徑KEGG通路顯示,在FB1與FB2之間的差異基因中,乙烯信號途徑的EBF1/2基因發(fā)生了下調(diào)表達(dá),暗示了EIN3轉(zhuǎn)錄本可能得到積累并激活了下游的響應(yīng)因子。激素相關(guān)基因表達(dá)分析顯示乙烯合成限速酶基因MaACS2在FB2表達(dá)迅速升高,而生長素中部分基因也在這個時間段高表達(dá)。油菜素內(nèi)脂基因主要在FB2和FB3時期表達(dá),赤霉素基因主要在FB4-FB6表達(dá)較高,脫落酸基因主要在FB6表達(dá)較高。AP2/ERF家族基因表達(dá)模式多樣,其中有一部分僅在FB2和FB3表達(dá)較高。而在MADS-box家族中有接近一半基因的FPKM是隨時間逐漸增加的。我們分別以這兩類基因作為特征表達(dá)模式,與所有在任一樣本中FPKM5的基因進(jìn)行共表達(dá)分析,鑒定到具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)的兩群基因(P19對應(yīng)AP2/ERF,P24對應(yīng)MADS-box)。構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖顯示P19中200多個基因之間顯示強(qiáng)關(guān)聯(lián)度,P24網(wǎng)絡(luò)圖顯示了相對松散的結(jié)構(gòu),其中具有40個以上鏈接的基因僅有一個,20-40個鏈接的基因有2個,10-20個鏈接的基因有10個3、珍珠白MaACS2與4個AP2/ERF基因功能分析MaACS2原位雜交結(jié)果表明其主要在花序的外圍表達(dá),切片形態(tài)數(shù)據(jù)顯示在這個階段花芽中花器官開始分化,這些結(jié)果暗示桑樹花芽性別分化過程中乙烯合成量增加,推測單性花形成屬于第一種花性別分化模型,即在花器官發(fā)育早期形成兩性起始原基,隨后雌花中的雄蕊原基發(fā)育受到抑制,這個過程可能是乙烯在花器官分化早期大量形成的結(jié)果。TENUL檢測顯示在花萼內(nèi)側(cè)有顯著的綠色熒光信號,暗示乙烯通過導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抑制雄蕊的發(fā)育。采用AVG與乙烯利處理FB2時期的花芽,隨后檢測有關(guān)基因的表達(dá),結(jié)果顯示乙烯利處理后MaDREB-AI亞群在第7天表達(dá)顯著升高；而AVG處理后,相關(guān)基因表達(dá)與以往研究不一致。在煙草中異源表達(dá)AP2/ERF基因?qū)е聼煵莼òl(fā)育異常,花瓣發(fā)育不全,雌蕊突出,雄蕊數(shù)量減少且部分雄蕊發(fā)育異常。本研究通過生物信息學(xué)的方法在川�；蛑需b定到29個乙烯合成與信號傳導(dǎo)相關(guān)基因,序列分析表明,其在序列結(jié)構(gòu),保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化等方面與其他物種具有較高的保守性,暗示其可能發(fā)揮同樣的功能。珍珠白花芽早期發(fā)育形態(tài)變化及轉(zhuǎn)錄組分析,顯示在花芽中花器官分化時期有大量基因表達(dá)變化劇烈。乙烯合成限速酶基因MaACS2在FB2表達(dá)顯著增加,生長素協(xié)同乙烯一起發(fā)揮作用,暗示乙烯在雌花發(fā)育中發(fā)揮一定的作用。MaACS2原位雜交結(jié)果顯示其表達(dá)在花序的外圍。TENUL檢測顯示花萼內(nèi)側(cè)存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,轉(zhuǎn)基因煙草花發(fā)育異常,這些結(jié)果暗示珍珠白雌花發(fā)育過程中,乙烯可能通過引起細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制雄蕊,促進(jìn)雌蕊發(fā)育的作用。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S888.2
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本文編號：1308447