本文關(guān)鍵詞：新孢子蟲ROP5和ROP16的功能及作用機(jī)制

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【摘要】：犬新孢子蟲(Neospora canium)為頂復(fù)亞門原蟲,主要引起牛的流產(chǎn)和犬的神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能障礙。與弓形蟲、瘧原蟲等其它頂復(fù)亞門原蟲相比,關(guān)于新孢子蟲蛋白功能和致病機(jī)制的研究報(bào)道較少。本研究擬開展新孢子蟲棒狀體蛋白(ROP)的研究,希望解析幾種ROP的功能和作用機(jī)制。頂復(fù)亞門原蟲的ROP種類很多,多種ROP在蟲體生命活動中具有重要功能,弓形蟲和瘧原蟲的有些ROP已經(jīng)被確定為重要的毒力因子。目前對于新孢子蟲的ROP研究報(bào)道較少,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)新孢子蟲ROP18是假基因,分析發(fā)現(xiàn)ROP5和ROP16能在蟲體內(nèi)正常表達(dá),作者擬對新孢子蟲的ROP5和ROP16進(jìn)行系統(tǒng)研究。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)新孢子蟲ROP5在基因組中存在三個重復(fù)拷貝,預(yù)測其有1個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。利用同源重組技術(shù)構(gòu)建新孢子蟲ROP5基因缺失蟲株(△ROP5),及其基因回補(bǔ)蟲株(△ROP5-cm)。對ROP5各基因調(diào)控蟲株與母源蟲株比較研究顯示,AROP5的入侵和噬斑形成能力減弱,增殖速度減慢。BALB/c小鼠腹腔接種1×106△ROP5蟲株小鼠的腦荷蟲量降低,3×106AROP5對小鼠的致病力下降,ROP5是影響新孢子蟲致病力的重要因子。進(jìn)一步的比較研究發(fā)現(xiàn),AROP5的GRA7轉(zhuǎn)錄下調(diào),ROP17轉(zhuǎn)錄上調(diào),且△ROP5蟲株的GRA7不能定位于納蟲空泡膜,ROP17彌散分布于蟲體胞質(zhì)。各基因調(diào)控蟲株能刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ繼而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫因子GBP1、GBP2、IRGb6和IRGd的表達(dá),但是AROP5接種后引起GBP1、GBP2和IRGb6表達(dá)量比其它蟲株接種的細(xì)胞低。與母源蟲株相比,AROP5接種巨噬細(xì)胞Raw246.7后GBP1和GBP2向納蟲空泡膜上的聚集能力增強(qiáng)約40%,說明蟲體更容易被免疫細(xì)胞殺傷,初步證明ROP5通過調(diào)節(jié)GBP1和GBP2等細(xì)胞自主免疫途徑介導(dǎo)新孢子蟲的免疫逃避。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)新孢子蟲能磷酸化宿主細(xì)胞STAT3,但發(fā)生機(jī)制尚不可知。我們分析發(fā)現(xiàn)ROP16含有保守的核定位信號和磷酸激酶結(jié)構(gòu)域,KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)ROP16的下游分子為STAT3。為了明確ROP16與蟲體磷酸化宿主細(xì)胞STAT3之間的關(guān)系,我們構(gòu)建了 ROP16基因缺失蟲株(AROP16)、回補(bǔ)蟲株(△ROP16-cm)和過表達(dá)蟲株(ROP16-oe)。對各基因調(diào)控蟲株進(jìn)行比較研究,與母源蟲株相比,AROP16的噬斑形成能力和增殖能力減弱,△ROP16-cm和ROP16-oe增強(qiáng)。將各蟲株接種BALB/c小鼠30d后,發(fā)現(xiàn)△ROP16接種組小鼠腦荷蟲量降低,AROP16-cm和ROP16-oe組小鼠腦荷蟲量顯著增加;AROP16接種組小鼠死亡率降低,ROP16-oe組小鼠死亡率升高。表明ROP16是新孢子蟲發(fā)揮致病作用的重要因子。我們還發(fā)現(xiàn)與表達(dá)ROP16的蟲株相比,△ROP16感染宿主細(xì)胞24 h后STAT3的磷酸化水平減弱;pcDNA3.1-NcROP16轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后能磷酸化細(xì)胞STAT3,進(jìn)一步說明ROP16促進(jìn)新孢子蟲對宿主細(xì)胞STAT3的激活。我們對ROP16核定位信號和磷酸激酶結(jié)構(gòu)域突變體的研究顯示,mutROP16NLS不能進(jìn)入宿主細(xì)胞核,mutROP16PKc不能磷酸化細(xì)胞STAT3,說明核定位信號是ROP16進(jìn)入宿主細(xì)胞細(xì)胞核的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),磷酸激酶結(jié)構(gòu)域是在其發(fā)揮磷酸化功能的過程中起決定作用;對ROP16各基因調(diào)控蟲株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ANA1的凋亡進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),△ROP16感染組的細(xì)胞凋亡率顯著降低,說明新孢子蟲ROP16促進(jìn)了宿主細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：1306318