發(fā)布時間：2017-12-18 20:41

  本文關(guān)鍵詞：鹽脅迫下陸地棉根蛋白差異表達(dá)分析及耐鹽相關(guān)基因的功能鑒定

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【摘要】：棉花作為世界上一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,不僅是重要的天然纖維來源,而且也是重要的食用油來源。相對于其它主要作物來說,雖然棉花具有較高的耐鹽性,但是在高濃度的鹽堿土壤中,棉花的生長、產(chǎn)量和品質(zhì)會受到嚴(yán)重影響,尤其在種子萌發(fā)和苗期階段。因此,深入研究棉花應(yīng)對鹽脅迫的分子機(jī)制有助于我們利用基因工程手段提高棉花的耐鹽性。本研究利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技術(shù)鑒定出了陸地棉苗根部的早期鹽反應(yīng)蛋白,從蛋白質(zhì)水平上了解棉花耐鹽分子機(jī)理;克隆了與耐鹽相關(guān)的GhCYPL和GhCaM基因,并初步驗證了GhCYPL基因的功能。在本研究中,以耐鹽棉花品種ZMS23為材料,利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對棉花苗期根部差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析,鑒定出128個差異表達(dá)蛋白,其中有76(59.4%)個蛋白相對于對照來說表達(dá)上調(diào),52(40.6%)表達(dá)下調(diào)。根據(jù)蛋白質(zhì)功能分類,將這些蛋白主要劃分為以下幾個類別:脅迫反應(yīng)(23.4%)、碳和能量代謝(13.3%)、轉(zhuǎn)錄代謝(4.7%)、蛋白質(zhì)代謝(15.6%)、細(xì)胞膜和轉(zhuǎn)運(10.9%)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(3.1%)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(12.5%)、其它代謝(4.7%)和未知功能蛋白(11.7%),這些鹽反應(yīng)蛋白的多樣性反映出鹽脅迫條件下棉花根部代謝的靈活性,有助于增強(qiáng)棉花在鹽脅迫條件下的適應(yīng)能力。鹽脅迫下,利用iTRAQ技術(shù)首次鑒定到一些新的蛋白參與到細(xì)胞骨架(肌動蛋白相關(guān)蛋白2,ARP2、類成束蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋,FLAs),膜轉(zhuǎn)運(液泡膜內(nèi)在蛋白,TIP),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(類富含亮氨酸重復(fù)受體激酶,LRR-RLKs),脅迫與防衛(wèi)(類甜蛋白,TLP、普遍脅迫蛋白,USP、Dirigent-like蛋白,DIR、脫水相關(guān)蛋白PCC13-62)等代謝過程,這些蛋白有助于進(jìn)一步了解植物在鹽脅迫條件下的分子機(jī)制。隨后對過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)和蘋果酸脫氫酶(MDH)的酶活性進(jìn)行檢測,經(jīng)數(shù)據(jù)分析得出這些酶的活性與蛋白質(zhì)豐度變化呈正相關(guān),進(jìn)一步驗證了iTRAQ技術(shù)是一個能同時進(jìn)行大量蛋白定性和定量的可靠技術(shù)。利用qRT-PCR技術(shù)分析POD、SOD、GST、MDAR和MDH在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況,其中有4個蛋白在轉(zhuǎn)錄水平與蛋白質(zhì)水平上表達(dá)呈正相關(guān),這些結(jié)果說明鹽脅迫條件下棉花根部蛋白質(zhì)組學(xué)的復(fù)雜性。比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析加深了我們對鹽脅迫條件下植物耐鹽分子機(jī)制的了解�？寺￡懙孛轌hCYPL全長基因,長度為911bp,包含一個621bp的開放閱讀框,編碼207個氨基酸。該基因多肽鏈序列含有植物親環(huán)素基因特有的氨基酸序列KSGKPLH,含有11個磷酸化位點,1個糖基化位點和1個肽脯氨酞順反異構(gòu)酶(PPIase)的標(biāo)志序列FKGSAFHRIIPNFMIQGG�；蚬δ茴A(yù)測顯示該基因可能參與蛋白的折疊、裝配、轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)的等重要過程。qRT-PCR分析顯示GhCYPL基因在鹽脅迫條件下表達(dá)上調(diào),暗示該基因可能在增強(qiáng)棉花鹽脅迫條件下的適應(yīng)性過程中起一定作用�？寺￡懙孛轌hCa M全長基因,長度為806bp,包含一個441bp的編碼區(qū),86bp5’端非編碼區(qū)和279bp 3’非編碼區(qū),編碼147個氨基酸,蛋白預(yù)測顯示蛋白分子量16.61KD,等電點為4.81.該蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含有4個EF臂結(jié)構(gòu)域和Ca2+結(jié)合位點,表明該蛋白與其它植物鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)類似,推測陸地棉GhCaM蛋白可能參與信號傳導(dǎo),離子通道調(diào)控,生長發(fā)育和抗病抗逆等生理過程。qRT-PCR數(shù)據(jù)分析顯示GhCYPL基因在鹽脅迫條件下表達(dá)上調(diào),推測該基因可能參與了棉花鹽脅迫條件下的信號傳導(dǎo)過程。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced genes silencing,VIGS)系統(tǒng)在陸地棉ZMS23幼苗中研究GhCYPL的基因功能。通過qRT-PCR檢測得出,GhCYPL-silencing植株的GhCYPL基因的相對表達(dá)量降低了88.02%(pTRV2-空載作為陰性對照),說明VIGS基因沉默系統(tǒng)效率較高,可用于單個基因研究。檢測結(jié)果顯示,鹽脅迫條件下GhCYPL-silencing植株真葉中丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)的含量遠(yuǎn)高于陰性對照,說明GhCYPL基因表達(dá)參與降低H2O2的累積和脂質(zhì)過氧化水平的過程。檢測鹽脅迫條件下GhCYPL-silencing植株和陰性對照植株中過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的酶活性,發(fā)現(xiàn)GhCYPL基因表達(dá)與SOD、POD和CAT酶活呈正相關(guān),而這些酶可以降解H2O2,導(dǎo)致MDA含量降低。因此,可推測出GhCYPL蛋白是一個通過調(diào)節(jié)抗氧化物酶的活性來控制活性氧(ROS)的水平的調(diào)節(jié)因子。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S562

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王保明;譚曉風(fēng);;油茶親環(huán)素基因的鑒定與其在大腸桿菌中的表達(dá)[J];中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報;2011年10期

2 王雪;馬駿;張桂寅;李喜煥;王省芬;馬峙英;;黃萎病菌脅迫條件下棉花葉片的蛋白質(zhì)組分析[J];棉花學(xué)報;2007年04期

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本文編號：1305579