本文關(guān)鍵詞：14-3-3γ對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)

  更多相關(guān)文章： 14-3-3γ 乳蛋白合成 細(xì)胞增殖 奶牛乳腺上皮細(xì)胞 蛋氨酸

【摘要】：奶牛的乳品質(zhì)是衡量經(jīng)濟(jì)效益的重要標(biāo)準(zhǔn)。乳蛋白的含量是牛奶品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。我國(guó)奶牛普遍存在乳蛋白含量偏低的重大問(wèn)題,因此亟需闡明乳蛋白合成的機(jī)理,從而找到改善乳品質(zhì)的有效技術(shù)途徑。乳蛋白合成機(jī)理是分子生物學(xué)和泌乳生理學(xué)領(lǐng)域重要的課題之一。目前研究已經(jīng)取得了很多重大的進(jìn)展,證實(shí)了JAK/Stat5和mTOR/S6K1信號(hào)途徑對(duì)于乳蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯是至關(guān)重要的。另外,乳蛋白合成還直接受到乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖情況的影響。14-3-3蛋白廣泛分布于各種生物體組織和細(xì)胞中,參與很多生物學(xué)過(guò)程,包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。14-3-3蛋白決定其底物的亞細(xì)胞定位,以促進(jìn)或抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),包括mTOR也能夠被14-3-3調(diào)節(jié)。14-3-3蛋白具有不同的功能,并與很多底物發(fā)生相互作用。盡管進(jìn)行了廣泛的研究,但14-3-3對(duì)蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞增殖發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)行深入探索。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)蛋白質(zhì)雙向電泳和質(zhì)譜鑒定分析發(fā)現(xiàn)14-3-3γ與乳蛋白合成相關(guān),提示14-3-3γ可能參與乳蛋白合成的調(diào)控過(guò)程。本研究針對(duì)14-3-3γ的泌乳調(diào)節(jié)功能、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)功能、相互作用蛋白鑒定等進(jìn)行分析,旨在揭示14-3-3γ通過(guò)互作蛋白調(diào)控乳蛋白合成和細(xì)胞增殖的分子機(jī)理。實(shí)驗(yàn)首先采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞中cytokeratin 18和β-酪蛋白的表達(dá),以鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純度和泌乳功能。添加濃度為0.6m M的蛋氨酸處理細(xì)胞24h,通過(guò)western blotting技術(shù)檢測(cè)蛋氨酸對(duì)14-3-3γ和β-酪蛋白表達(dá)的影響。利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蛋氨酸對(duì)14-3-3γ表達(dá)的影響。采用Casy#174;Model DT細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)蛋氨酸刺激對(duì)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)添加蛋氨酸后細(xì)胞的增殖率和周期的變化。進(jìn)一步構(gòu)建14-3-3γ的真核表達(dá)載體進(jìn)行14-3-3γ過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn),合成14-3-3γ的抑制片段進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)。通過(guò)western blotting技術(shù)檢測(cè)了14-3-3γ過(guò)表達(dá)和抑制后m TOR、p-mTOR、Stat5a、p-Stat5a、Cyclin D1和β-酪蛋白蛋白質(zhì)水平的變化。利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了14-3-3γ過(guò)表達(dá)和抑制后對(duì)p-m TOR和p-Stat5a水平的影響。采用Casy#174;Model DT細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)14-3-3γ過(guò)表達(dá)和抑制對(duì)細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率和細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀和質(zhì)譜鑒定技術(shù)尋找與14-3-3γ相互作用并且與乳蛋白合成有關(guān)的蛋白質(zhì),并探究14-3-3γ過(guò)表達(dá)和抑制對(duì)互作蛋白表達(dá)的影響,以及過(guò)表達(dá)互作蛋白后乳蛋白合成的變化。本研究確定了蛋氨酸對(duì)14-3-3γ表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示加蛋氨酸組的細(xì)胞中14-3-3γ和β-酪蛋白表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組。加蛋氨酸使乳腺上皮細(xì)胞數(shù)明顯增加,且細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)。此外,加蛋氨酸組的乳腺上皮細(xì)胞增殖率顯著高于空白對(duì)照組,加蛋氨酸組的處于S期和G2-M期的乳腺上皮細(xì)胞百分比均明顯升高,而G0-G1期細(xì)胞百分比明顯下降。這表明乳蛋白合成和細(xì)胞增殖與14-3-3γ有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了14-3-3γ過(guò)表達(dá)和抑制對(duì)乳蛋白合成和細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示14-3-3γ過(guò)表達(dá)可以上調(diào)mTOR、Stat5a和β-酪蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,并促進(jìn)mTOR和Stat5a兩個(gè)蛋白發(fā)生磷酸化,而抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過(guò)表達(dá)相反。過(guò)表達(dá)14-3-3γ使細(xì)胞數(shù)明顯增加,且細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)。此外,過(guò)表達(dá)14-3-3γ的乳腺上皮細(xì)胞增殖率顯著高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組,且處于S期和G2-M期的細(xì)胞百分比均明顯升高,而G0-G1期細(xì)胞百分比明顯下降。抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過(guò)表達(dá)相反。另外,過(guò)表達(dá)和抑制14-3-3γ基因的結(jié)果顯示,14-3-3γ正調(diào)節(jié)Cyclin D1的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明14-3-3γ正向調(diào)節(jié)m TOR和Stat5a的磷酸化水平從而促進(jìn)乳蛋白合成和細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)對(duì)14-3-3γ相互作用蛋白進(jìn)行了鑒定,共鑒定出44種蛋白質(zhì)與14-3-3γ相互作用,分為8類:與轉(zhuǎn)錄、翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白以及酶類。蛋白質(zhì)翻譯對(duì)于乳蛋白合成至關(guān)重要,因此在翻譯相關(guān)蛋白中選擇了e IF1AX、RPS7和e IF5這3個(gè)蛋白作為研究對(duì)象,驗(yàn)證它們與14-3-3γ蛋白是否真的存在相互作用。實(shí)驗(yàn)利用western blotting、免疫熒光共定位和熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)對(duì)e IF1AX、RPS7和e IF5與14-3-3γ之間是否存在直接的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)e IF1AX、RPS7和e IF5這3個(gè)蛋白與14-3-3γ蛋白是特異性結(jié)合的,3個(gè)蛋白與14-3-3γ蛋白共定位指數(shù)均在90%以上,3個(gè)蛋白與14-3-3γ蛋白的FRET效率均在20%-35%,顯著高于對(duì)照組(5%)。這表明e IF1AX、RPS7和e IF5這3個(gè)蛋白與14-3-3γ蛋白均存在直接的相互作用,14-3-3γ蛋白調(diào)節(jié)泌乳的功能很可能與這3個(gè)互作蛋白有關(guān)。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了蛋氨酸對(duì)e IF1AX、RPS7和e IF5表達(dá)的影響。結(jié)果表明,添加蛋氨酸后,細(xì)胞中e IF1AX、RPS7、e IF5和β-酪蛋白的表達(dá)量均顯著升高,這說(shuō)明e IF1AX、RPS7和e IF5這3個(gè)蛋白可能與乳蛋白合成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)又檢測(cè)了14-3-3γ過(guò)表達(dá)和抑制對(duì)e IF1AX、RPS7和e IF5表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)14-3-3γ基因后,細(xì)胞中e IF1AX、RPS7和eIF5的表達(dá)量均顯著增加,而抑制14-3-3γ基因后,細(xì)胞中e IF1AX、RPS7和e IF5的表達(dá)量均顯著降低。此外,14-3-3γ基因過(guò)表達(dá)可顯著提高e IF2α的表達(dá)量并顯著降低p-e IF2α的水平,而14-3-3γ基因抑制的結(jié)果與過(guò)表達(dá)相反。e IF1AX、RPS7和e IF5三個(gè)基因分別過(guò)表達(dá)均導(dǎo)致e IF2α和β-酪蛋白的表達(dá)量顯著增加,而p-e IF2α的水平明顯降低。上述結(jié)果表明,14-3-3γ通過(guò)調(diào)節(jié)e IF1AX、RPS7和e IF5蛋白的表達(dá)水平,從而調(diào)節(jié)乳蛋白合成和細(xì)胞增殖。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王月影;朱河水;王艷玲;;乳腺上皮細(xì)胞的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)研究進(jìn)展[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2008年06期

2 楊櫟;李鍵;吳媛媛;田甜;畢琳;梁天宇;;綠色熒光蛋白基因在牦牛乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)的研究[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年03期

3 吳媛媛;李鍵;楊櫟;畢琳;田甜;;牦牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)的研究[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年04期

4 弓超;王凌云;周歡敏;;牛乳腺上皮細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年07期

5 李吉霞;葛秀國(guó);王文秀;張涌;;牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年07期

6 符梅;熊顯榮;高川;李宇;王樹(shù)茂;李鍵;;麥洼牦牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2012年11期

7 郝明超;劉r，

本文編號(hào)：1301018