發(fā)布時間：2017-12-17 16:25

  本文關(guān)鍵詞：L-精氨酸調(diào)控miR23b介導的自噬緩解運輸應(yīng)激中大鼠小腸黏膜上皮損傷

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【摘要】：動物夏季運輸過程中受到高溫、震動等多種因素刺激。導致機體全身血液再分配,腸道缺血損傷,細胞外源供應(yīng)受阻、營養(yǎng)受限。機體通過自噬實現(xiàn)細胞內(nèi)能源再循環(huán)。本研究選擇大鼠運輸應(yīng)激模型與大鼠IEC-6細胞熱應(yīng)激模型分別進行功能與機制的研究,兩種模型高度相關(guān)。探討腸上皮細胞對應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答的作用機制及L-精氨酸的保護機制。1.運輸應(yīng)激導致大鼠空腸上皮損傷的機制研究采用大鼠熱與震動復合運輸應(yīng)激模型。結(jié)果顯示,35°C,O.1g相對離心力震蕩應(yīng)激1天或3天后,大鼠體重、直腸溫度、血清皮質(zhì)酮含量及HSP27/70mRNA表達均顯著升高。小腸黏膜絨毛頂端上皮細胞損傷、固有層裸露、細胞核皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹等結(jié)構(gòu)改變,絨毛頂端發(fā)生凋亡$通過基因芯片高通量篩選差異基因。結(jié)果顯示,在93個差異基因中,67個參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白應(yīng)答,11個參與自噬調(diào)節(jié),P53、MAPK和mTOR相關(guān)信號通路可能被激活。Q-PCR驗證結(jié)果與芯片趨勢一致。免疫組化和Westemblot結(jié)果顯示Casp3、Casp12和LC3在小腸絨毛頂端顯著升高,mTOR、P-AKT含量下降。結(jié)果表明,運輸應(yīng)激導致大鼠小腸黏膜,上皮損傷,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與應(yīng)激應(yīng)答并誘導自噬,可能是損傷應(yīng)答中的細胞存活機制。2.MiR23b在IEC6細胞中的功能性研究采用IEC-6細胞熱應(yīng)激模型,并與大鼠運輸模型關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示,熱應(yīng)激后miR23b下調(diào),通過軟件預(yù)測miR23b潛在靶基因及基因結(jié)合靶點,并通過報告基因試驗驗證。最終確定UBE20為miR23b靶基因^深度測序結(jié)果提示,miR23b敲低后,142個差異基因中集中分布在自噬、泛素化、凋亡及應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答有關(guān)GO及pathway中。通過對差異基因進行分析,表明miR23b可能通過調(diào)控細胞泛素化水平影響細胞自噬、參與細胞應(yīng)激機制調(diào)控。3.L-Arg對miR23b介導的應(yīng)激損傷的調(diào)控44°C熱應(yīng)激1.5小時后,細胞鏡下明顯損傷,自噬體增多,mREP-GFP-LC3示蹤技術(shù)顯示自噬活性明顯升高,miR23b應(yīng)激后下降。5mM濃度的L-Arg組能夠提高熱應(yīng)激中miR23b表達水平,抑制熱應(yīng)激引起的IEC-6細胞自噬,調(diào)節(jié)miR23b靶基因UBE20及泛素化相關(guān)基因UBE2R2、UBE2D1、UBR3、Smurf2等mRNA表達,降低Casp3、Casp9的表達,趨勢與miR23b過表達熱應(yīng)激組一致。對L*Arg組大鼠連續(xù)7天補充L-Ar?后進行運輸應(yīng)激。結(jié)果-/顯爾,與應(yīng)激組比,補充L-Arg后大鼠體重有所升高,血清生化指標有所恢復。形態(tài)學觀察顯示,大鼠空腸黏膜損傷減輕。Q-PCR結(jié)果顯示miR23b應(yīng)激后下降而L-Arg可以上調(diào)miR23b,自噬變化趨勢與體外試驗一致。提示L-Arg通過調(diào)控miR23b對應(yīng)激引起的大鼠小腸黏膜上皮細胞發(fā)揮保護作用。結(jié)論:1、運輸應(yīng)激導致大鼠空腸黏膜細胞損傷,激活大鼠空腸上皮細胞的自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,通過調(diào)節(jié)Akt-TSC-mTOR誘導了細胞自噬。2、miR23b參與機體應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答的過程。UBE20是miR23b的靶基因,miR23b可能通過泛素-蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)自噬。3、L-Arg通過上調(diào)miR23b,對應(yīng)激中自噬和泛素化進行調(diào)控,緩解應(yīng)激造成的上皮細胞損傷。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.3

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本文編號：1300792