本文關鍵詞：逸出介導的艾美耳球蟲清除的分子機制的初步研究

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【摘要】：頂復門原蟲是一類嚴格的胞內(nèi)寄生病原,在細胞內(nèi)的繁殖周期需經(jīng)過入侵、細胞內(nèi)增殖及從宿主細胞中逸出三個過程。在上述三個過程中,逸出作為兩次胞內(nèi)周期的連接點對于本門原蟲的生存和繁殖具有重要意義。近年來,隨著研究的深入,免疫因素介導的頂復門原蟲逸出的研究逐步興起。我研究小組于2011年發(fā)現(xiàn)激活后的淋巴細胞在體外可以誘導入侵細胞不久的柔嫩艾美耳球蟲子孢子逸出。在此基礎上我們提出了免疫因素誘導子孢子逸出可能是機體清除艾美耳球蟲的一種有效途徑的假說。本研究通過體外及體內(nèi)實驗對艾美耳球蟲子孢子逸出的及逸出介導的艾美耳球蟲清除的分子機制進行了研究。在研究中我們首先建立了基于流式細胞儀檢測艾美耳球蟲子孢子逸出水平的體外檢測平臺,在此基礎上對子孢子的逸出機制進行了初步研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟲體經(jīng)誘導逸出的能力與其在細胞中的發(fā)育程度相關,這為我們在體內(nèi)研究中選擇檢測時間點提供了參考；進一步地我們發(fā)現(xiàn)鈣離子是介導蟲體逸出的關鍵分子,這為我們有的放矢地選擇可誘導子孢子逸出的免疫相關分子提供了依據(jù)。在尋找可誘導子孢子逸出的免疫相關分子的過程中我們發(fā)現(xiàn)一氧化氮可以誘導艾美耳球蟲子孢子逸出,這種誘導性逸出沒有蟲種和宿主細胞特異性,且經(jīng)誘導逸出的蟲體再次入侵細胞的能力和在雞體內(nèi)的繁殖能力分別下降了67.2%和52.4%。在上述研究的基礎上我們利用一氧化氮誘導宿主細胞中的子孢子逸出,將逸出的子孢子轉(zhuǎn)移到不同濃度的巨噬細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中,最終發(fā)現(xiàn)逸出的子孢子很快被巨噬細胞吞噬、殺滅。至此我們初步建立了一個以免疫相關因子誘導子孢子逸出并通過巨噬細胞將其清除的體外模型。該模型的建立為體內(nèi)研究提供了理論上的依據(jù),模型上的參考。根據(jù)前述發(fā)現(xiàn),我們將體內(nèi)研究的重點集中在經(jīng)艾美耳球蟲免疫的宿主再次感染后,在球蟲的子孢子階段研究宿主免疫系統(tǒng)是否會誘導剛?cè)肭值淖渔咦右莩?進而將其清除。鑒于體內(nèi)研究的復雜性,我們首先需要選擇一種在動物體內(nèi)檢測逸出發(fā)生的可靠手段。我們先后嘗試了利用Real-Time PCR方法檢測子孢子逸出特異性蛋白的基因表達水平、通過基因組Real-Time PCR方法對系統(tǒng)中子孢子數(shù)量進行定性研究、基于組織學技術對子孢子逸出的發(fā)生進行研究。我們發(fā)現(xiàn)基于組織學技術的檢測方法更具有可行性。通過組織切片的橙黃G染色發(fā)現(xiàn)免疫攻蟲組腸道中的子孢子數(shù)量略少于未免疫攻蟲組；通過免疫組織化學染色則發(fā)現(xiàn)免疫攻蟲組的腸道中沒有蟲體定殖的納蟲空泡的比例高于未免疫攻蟲組。上述實驗結(jié)果提示宿主體內(nèi)有可能存在逸出介導的艾美耳球蟲清除的現(xiàn)象。綜上所述,本研究結(jié)合體外和體內(nèi)實驗,進一步闡示了逸出介導的艾美耳球蟲清除途徑存在的可能性。在今后的研究中需要在體內(nèi)實驗中尋找到更加可靠的逸出檢測手段,獲得更加確實的數(shù)據(jù),從而最終證明逸出介導的艾美耳球蟲清除途徑在宿主免疫系統(tǒng)中的存在
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7

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本文編號：1300130