本文關(guān)鍵詞：芥藍(lán)蘿卜硫苷生物合成主要基因表達(dá)特性及功能鑒定

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【摘要】：芥藍(lán)(Brassica oleracea var.alboglabra Bailey),屬于蕓薹屬,廣泛分布于中國華南地區(qū)、臺灣、日本及東南亞。芥藍(lán)具有很高的營養(yǎng)價值,含有豐富的維生素C、硫苷、類胡蘿卜素和酚類化合物等。硫代葡萄糖苷,簡稱硫苷,是植物中富含氮和硫的次生代謝物。硫苷及其衍生產(chǎn)物(異硫氰酸鹽、硫氰酸脂和腈類),在植物防御反應(yīng)、特殊風(fēng)味形成和抗癌等方面具有特殊作用。根據(jù)側(cè)鏈R的氨基酸來源不同,可以將硫苷分為脂肪族、芳香族及吲哚族硫苷。4-甲基亞磺酰丁基硫苷,又稱蘿卜硫苷,屬于脂肪族硫苷,其降解產(chǎn)物為蘿卜硫素。蘿卜硫苷是十字花科植物中的重要次生代謝產(chǎn)物,具有抗癌、抗氧化和抑菌活性。本研究以不同蘿卜硫苷含量的芥藍(lán)為材料,克隆了3個蘿卜硫苷生物合成結(jié)構(gòu)基因BCAT4、MAM1、CYP79F1和3個調(diào)控基因MYB28、MYB29和MYB76的全長序列,進(jìn)行同源性比對,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,并分析基因表達(dá)模式。另外,構(gòu)建MYB28的超表達(dá)和RNAi載體,通過花藥浸染法導(dǎo)入擬南芥以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入芥藍(lán),并測定轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)水平和硫苷含量。本研究為通過基因工程手段提高芥藍(lán)蘿卜硫苷含量奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:(1)從芥藍(lán)中分別克隆到結(jié)構(gòu)基因BCAT4(Genbank登錄號:KP295464)、MAM1(Genbank登錄號:KP295465)、CYP79F1(Genbank登錄號:KP295466)和調(diào)控基因MYB28(Genbank登錄號:KP723785)、MYB29(Genbank登錄號:KP723786)和MYB76(Genbank登錄號:KP723787)。序列分析表明,BCAT4的cDNA全長序列1394bp,5'非翻譯區(qū)42bp,最大開放閱讀框1143bp,3'非翻譯區(qū)209bp,編碼380個氨基酸,編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為42kDa,等電點為9.09。MAM1的cDNA全長序列1560bp,5'非翻譯區(qū)291bp,最大開放閱讀框1164bp,3'非翻譯區(qū)105bp,編碼387個氨基酸,編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為42kDa,等電點為5.99。CYP79F1的cDNA全長序列1685bp,5'非翻譯區(qū)27bp,最大開放閱讀框1626bp,3'非翻譯區(qū)32bp,編碼541個氨基酸,編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為61kDa,等電點為8.26。MYB28的cDNA全長序列1257bp,5'非翻譯區(qū)138bp,最大開放閱讀框1020bp,3'非翻譯區(qū)99bp,編碼339個氨基酸,編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為38kDa,等電點為6.87。MYB29的cDNA全長序列1081bp,5'非翻譯區(qū)24bp,最大開放閱讀框966bp,3'非翻譯區(qū)91bp,編碼321個氨基酸,編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為84kDa,等電點為5.07。MYB76的cDNA全長序列1066bp,5'非翻譯區(qū)23bp,最大開放閱讀框1017bp,3'非翻譯區(qū)26bp,編碼338個氨基酸,編碼的假定蛋白質(zhì)的分子量為88kDa,等電點為5.06。(2)運(yùn)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析了芥藍(lán)蘿卜硫苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因(BCAT4、MAM1、CYP79F1)和調(diào)控基因(MYB28、MYB29和MYB76)在不同品種芥藍(lán)和芥藍(lán)不同部位以及不同發(fā)育時期的表達(dá)水平。結(jié)果表明,芥藍(lán)蘿卜硫苷合成相關(guān)基因具有組織表達(dá)特異性,主要在子葉、葉片和莖中表達(dá),子葉、葉片和莖中基因表達(dá)量高于花和種子。芥藍(lán)蘿卜硫苷合成相關(guān)基因在葉片不同發(fā)育時期的表達(dá)量不同,主要在成熟葉中表達(dá),成熟葉的基因表達(dá)量高于幼葉。芥藍(lán)蘿卜硫苷合成相關(guān)基因表達(dá)水平與其相應(yīng)的蘿卜硫苷含量一致。成熟前期(蘿卜硫苷含量低)的BCAT4、MAM1和MYB28表達(dá)量高于商品成熟后期(蘿卜硫苷含量高),而成熟前期的CYP79F1、MYB29和MYB76表達(dá)量則低于商品成熟后期。(3)根據(jù)芥藍(lán)蘿卜硫苷合成基因MYB28的cDNA序列設(shè)計特異引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增,得到約1200 bp目的片段,將目的片段連接到T載體上,用BamHI和SmaI雙酶切,回收小片段,再和回收到的pFGC5941載體片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落,提取質(zhì)粒,用BamHI和SmaI雙酶切檢測,然后利用凍融法,把構(gòu)建好的超表達(dá)載體轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EHA105中保存。同時,根據(jù)芥藍(lán)蘿卜硫苷合成基因MYB28的cDNA序列設(shè)計特異引物擴(kuò)增出270bp的干擾片段,按照相反方向分別連接到pFGC5941載體上,成功構(gòu)建了RNAi表達(dá)載體。(4)通過花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將載體導(dǎo)入芥藍(lán)。PCR和Southern雜交檢測結(jié)果表明MYB28基因已轉(zhuǎn)入擬南芥和芥藍(lán)中。分析轉(zhuǎn)基因植株的脂肪族硫苷合成基因表達(dá)水平,測定轉(zhuǎn)基因植株的脂肪族硫苷含量。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)學(xué)特征并未發(fā)生改變。超表達(dá)植株中,脂肪族硫苷合成基因表達(dá)水平上升,脂肪族硫苷含量升高,其中超表達(dá)芥藍(lán)蘿卜硫苷含量增加97%。RNAi植株中,脂肪族硫苷合成基因表達(dá)水平下降,脂肪族硫苷含量降低。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S635.9

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