本文關鍵詞：小菜蛾對Bt Cry1Ac毒素抗性的分子機制研究

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【摘要】：蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)屬于革蘭氏陽性昆蟲病原微生物,由于其高效安全,Bt制劑已經(jīng)成為世界上用量最大的微生物殺蟲劑。Bt在產(chǎn)孢過程中產(chǎn)生的Cry類殺蟲晶體蛋白基因也已被轉(zhuǎn)入到多種重要的糧棉作物(Bt作物)中用于田間害蟲防治,在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用。然而,Bt制劑大量和不合理使用以及Bt作物的大面積種植不可避免的導致田間害蟲的Bt抗性進化。而對昆蟲Bt抗性機制認識的不足,正嚴重制約著Bt抗性治理和新型Bt殺蟲蛋白的開發(fā)與應用,并嚴重威脅著轉(zhuǎn)Bt基因作物的使用壽命。因此,考慮到Bt生物殺蟲劑的經(jīng)濟和環(huán)境重要性,闡明昆蟲Bt抗性分子機制對于延緩田間害蟲Bt抗性進化和Bt的可持續(xù)應用具有重要的意義。小菜蛾(Plutella xylostella)是一種世界性分布的十字花科作物重要害蟲,它能快速對各種殺蟲劑形成抗藥性,每年能在世界范圍內(nèi)引起40 50億美元的巨大經(jīng)濟損失。而且,小菜蛾是第一個在田間被報道對Bt噴灑制劑產(chǎn)生抗性的害蟲。因此,小菜蛾已成為研究復雜的Bt抗性分子機制的模式昆蟲,特別是在最近其全基因組測序完成并公開后,這點表現(xiàn)的尤為明顯。盡管近年來研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾Bt Cry1Ac抗性與Bt R-1抗性基因座內(nèi)一個ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因(Px ABCC2)的基因突變有關,但是對小菜蛾Bt Cry1Ac抗性的分子機制的全面理解仍然任重而道遠。在本論文中,我們以多個小菜蛾Bt敏感和Bt Cry1Ac毒素/Btk制劑抗性種群為研究對象,通過一系列昆蟲毒理學、昆蟲生理學、分子生物學、生物化學、分子遺傳學和生物信息學等技術和方法對小菜蛾Bt Cry1Ac抗性分子機制進行了深入研究。研究結(jié)果表明,小菜蛾Bt Cry1Ac抗性與中腸鈣粘蛋白基因(Px CAD)和中腸ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因(Px ABCH1)無關,而是與Bt R-1抗性基因座內(nèi)有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號途徑上游轉(zhuǎn)錄激活的Px MAP4K4基因反式調(diào)控Bt R-1抗性基因座外的中腸膜結(jié)合形式的堿性磷酸酶基因(Pxm ALP)和中腸ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因(Px ABCG1)以及Bt R-1抗性基因座內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因(Px ABCC1-3)的差異表達密切相關。本研究結(jié)果對新型Bt作物的研發(fā)、害蟲對Bt作物/Bt制劑抗性的田間檢測與綜合治理、新型Bt殺蟲蛋白的開發(fā)與可持續(xù)應用均有重要的理論和實踐意義。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:一、小菜蛾的室內(nèi)飼養(yǎng)、抗性汰選與毒力生物測定利用實驗室良好的昆蟲飼養(yǎng)條件以及獨特的甘藍蘿卜苗法形成了一整套成熟標準的小菜蛾室內(nèi)大規(guī)模人工隔離飼養(yǎng)技術,同時,形成了標準的小菜蛾幼蟲Bt抗性汰選和毒力生物測定方法。毒力生物測定結(jié)果顯示,與Bt敏感小菜蛾種群相比,所有4個抗性小菜蛾種群對Bt Cry1Ac毒素/Btk制劑均形成了較高的抗性水平,為后續(xù)功能實驗的開展提供了良好的供試蟲源。二、Bt Cry1Ac毒素與小菜蛾中腸BBMV蛋白結(jié)合分析利用Western Blot技術對Bt Cry1Ac活化毒素與小菜蛾中腸BBMV蛋白的結(jié)合情況進行半定量分析,結(jié)果表明,所有Bt抗性小菜蛾種群中腸BBMV與Cry1Ac活化毒素的結(jié)合水平顯著性降低,這表明這些Bt抗性小菜蛾種群的中腸受體發(fā)生變化(受體基因突變或表達量改變)是其對Bt產(chǎn)生抗性的主要分子機制。三、小菜蛾中腸CAD基因與Bt抗性的關系研究通過對小菜蛾Bt敏抗種群中腸Px CAD基因的全長c DNA序列進行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn),該基因并未在Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后,利用實時熒光定量PCR(q PCR)技術對Px CAD基因表達量進行分析后發(fā)現(xiàn),小菜蛾Bt敏抗種群間該基因的轉(zhuǎn)錄水平并沒有顯著性差異。RNA干擾(RNAi)實驗結(jié)果表明Px CAD基因表達量降低并不影響小菜蛾敏感種群幼蟲對Cry1Ac毒素的敏感性。而且,遺傳連鎖實驗證實Px CAD基因與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀并不連鎖。因此,小菜蛾中腸Px CAD基因與Bt Cry1Ac抗性分子機制無關。四、小菜蛾中腸ALP基因與Bt抗性關系的研究測定小菜蛾Bt敏抗種群的中腸BBMV樣品中ALP和APN的酶活力后結(jié)果顯示,與Bt敏感小菜蛾種群相比,所有Bt抗性的小菜蛾中腸BBMV樣品中ALP酶活力均顯著性降低,而APN的酶活力沒有顯著性變化,這表明小菜蛾中腸ALP基因可能與小菜蛾Bt抗性相關。隨后,利用RACE技術克隆了小菜蛾中腸膜結(jié)合形式的ALP基因(Pxm ALP)的全長c DNA序列。序列比對分析發(fā)現(xiàn),小菜蛾敏抗種群間Pxm ALP基因序列并無穩(wěn)定的突變位點。q PCR結(jié)果顯示,與Bt敏感種群相比,所有小菜蛾Bt抗性種群的Pxm ALP基因在中腸組織中轉(zhuǎn)錄水平顯著性降低。利用ELISA、免疫熒光定位和細胞毒性測定實驗證實了Sf9細胞重組表達的Pxm ALP蛋白可以作為Bt Cry1Ac毒素的功能性受體。RNAi實驗結(jié)果表明Pxm ALP基因表達量降低可以導致小菜蛾幼蟲對Cry1Ac毒素的敏感性顯著性降低。而且,遺傳連鎖實驗證實Pxm ALP基因中腸表達量降低與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀緊密連鎖。因此,小菜蛾中腸Pxm ALP基因表達量降低與Bt Cry1Ac抗性分子機制密切相關。五、小菜蛾中腸ABCC1-5基因與Bt抗性關系的研究利用遺傳連鎖圖譜定位數(shù)據(jù)、小菜蛾和家蠶全基因組數(shù)據(jù)以及小菜蛾和家蠶基因之間的遺傳共線性關系成功組裝了3.15Mb大小的Bt R-1抗性基因座。生物信息學分析發(fā)現(xiàn),Bt R-1抗性基因座內(nèi)含有5個ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因(Px ABCC1-5)。在小菜蛾Bt敏抗種群中對Px ABCC1-5基因的全長c DNA序列進行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn),這5個基因并未在Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后,q PCR實驗結(jié)果顯示,與小菜蛾Bt敏感種群相比,小菜蛾Bt抗性種群中腸Px ABCC2和Px ABCC3基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著性降低,而中腸Px ABCC1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著性升高。利用RNAi沉默中腸Px ABCC2和Px ABCC3基因的表達量后能顯著降低小菜蛾敏感種群幼蟲對Bt Cry1Ac毒素的敏感性,而組合干擾Pxm ALP、Px ABCC2和Px ABCC3基因的表達量后能進一步降低其敏感性。更重要的是,遺傳連鎖實驗證實Px ABCC2和Px ABCC3基因表達量降低與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀緊密連鎖,然而Px ABCC1基因表達量升高與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀并不連鎖。因此,小菜蛾中腸Px ABCC2和Px ABCC3基因表達量降低與Bt Cry1Ac抗性分子機制密切相關。六、小菜蛾中腸MAP4K4基因與Bt抗性關系的研究生物信息學分析后發(fā)現(xiàn),Bt R-1抗性基因座內(nèi)還具有3個MAPK信號途徑基因,其中,Px MAP4K4基因位于MAPK信號途徑上游且緊鄰Px ABCC1-3基因。在小菜蛾Bt敏抗種群中對該基因的全長c DNA序列進行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn),該基因并未在Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后,q PCR實驗結(jié)果顯示,與小菜蛾Bt敏感種群相比,小菜蛾Bt抗性種群間中腸Px MAP4K4基因的轉(zhuǎn)錄水平升高,表明該基因在小菜蛾Bt抗性種群中轉(zhuǎn)錄激活。利用RNAi沉默小菜蛾抗性種群的中腸Px MAP4K4基因的表達量后能導致Pxm ALP、Px ABCC2和Px ABCC3基因的表達量顯著性升高以及Px ABCC1基因的表達量顯著性降低并最終重建小菜蛾抗性種群幼蟲對Bt Cry1Ac毒素的敏感性。因此,小菜蛾MAPK信號途徑上游轉(zhuǎn)錄激活的Px MAP4K4基因能反式調(diào)控Pxm ALP和Px ABCC1-3基因的表達量改變并最終導致小菜蛾對Bt Cry1Ac毒素產(chǎn)生高抗性。七、小菜蛾中腸ABCG1基因與Bt抗性關系的研究對本實驗室小菜蛾中腸轉(zhuǎn)錄組和RNA-Seq數(shù)據(jù)進行重新分析后發(fā)現(xiàn)一個全新的ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因(Px ABCG1或Pxwhite)在Bt抗性小菜蛾種群中表達量顯著性降低。隨后,在小菜蛾Bt敏抗種群中對該基因的全長c DNA序列進行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn),該基因并未在Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后,q PCR實驗結(jié)果顯示,與小菜蛾Bt敏感種群相比,小菜蛾Bt抗性種群間中腸Px ABCG1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著性降低。利用RNAi沉默中腸Px ABCG1基因的表達量后能顯著降低小菜蛾敏感種群幼蟲對Bt Cry1Ac毒素的敏感性。而且,遺傳連鎖實驗證實Px ABCG1基因表達量降低與小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性狀緊密連鎖。因此,小菜蛾中腸Px ABCG1基因表達量降低與Bt Cry1Ac抗性密切相關。八、小菜蛾中腸ABCH1基因與Bt抗性關系的研究對本實驗室小菜蛾中腸轉(zhuǎn)錄組和RNA-Seq數(shù)據(jù)進行重新分析后發(fā)現(xiàn)了另一個全新的ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因(Px ABCH1)在Bt抗性小菜蛾種群中表達量發(fā)生變化。在小菜蛾Bt敏抗種群中對該基因的全長c DNA序列進行PCR克隆和序列比對分析后發(fā)現(xiàn),該基因并未在Bt抗性小菜蛾中發(fā)生穩(wěn)定的基因突變。隨后,q PCR實驗結(jié)果顯示,在小菜蛾Bt敏抗種群間中腸Px ABCH1基因表達量并無顯著性差異。利用低劑量ds RNA進行RNAi沉默中腸Px ABCH1基因的表達量后并不影響小菜蛾敏感種群幼蟲對Bt Cry1Ac毒素的敏感性。因此,小菜蛾中腸Px ABCH1基因與Bt Cry1Ac抗性無關。然而,利用高劑量ds RNA進行RNAi沉默中腸Px ABCH1基因的表達量后卻能導致小菜蛾Bt敏抗小菜蛾種群在幼蟲期和蛹期全部死亡,這表明Px ABCH1基因可以作為基于RNAi害蟲防治和抗性治理策略的優(yōu)秀靶標基因�？傊�,這些研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了一系列小菜蛾Bt Cry1Ac抗性相關的關鍵基因并揭示了一種負責調(diào)控這些關鍵基因表達量的全新反式信號調(diào)控分子機制。因此,該研究在國際上首次全面闡明了小菜蛾田間進化Bt Cry1Ac抗性的分子機制。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S433.4
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本文編號：1299271