本文關(guān)鍵詞：干旱脅迫下大豆miR396基因家族表達(dá)分析及功能鑒定

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【摘要】：大豆是世界上植物蛋白質(zhì)和油脂的主要來源。在我國,大豆生產(chǎn)的增長速度遠(yuǎn)不能滿足國人消費需求的增長速度,供需的巨大缺口需要依靠進(jìn)口國際市場的轉(zhuǎn)基因大豆來滿足。大豆需水量高,對干旱脅迫十分的敏感,據(jù)統(tǒng)計由干旱造成的大豆減產(chǎn)大于其他不利因素的總和。分子育種技術(shù)已被公認(rèn)為是解決傳統(tǒng)育種技術(shù)難以解決的問題的有效手段,挖掘具有自主知識產(chǎn)權(quán)的可以利用的抗旱基因,培育大豆抗旱新品系,對發(fā)展我國大豆產(chǎn)業(yè)具有重大意義。植物microRNAs(miRNA)是一類小分子RNA,在調(diào)控植物生長發(fā)育和抵抗環(huán)境脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miR396是植物中公認(rèn)的保守miRNA家族之一,目前研究表明,miR396可通過調(diào)控生長調(diào)節(jié)因子(GRF)基因家族控制細(xì)胞增殖,并且與植物抵抗干旱脅迫響應(yīng)相關(guān),但大豆中miR396功能及調(diào)控作用尚不明確。本研究首先對干旱脅迫條件下大豆根和葉片形態(tài)及大豆miR396家族前體序列(Pre-mi R396)與GmGRF家族基因的表達(dá)變化進(jìn)行了分析;并通過5’-RACE和原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化兩種方法驗證了Gma-miR396與GmGRF家族基因的相互作用關(guān)系;進(jìn)一步通過在擬南芥中分別超表達(dá)大豆Pre-miR396對家族各成員基因的功能進(jìn)行了鑒定;并重點分析了轉(zhuǎn)基因擬南芥生物量及抗旱能力的變化。結(jié)果顯示,Gma-miR396介導(dǎo)的GmGRF網(wǎng)絡(luò)調(diào)控在調(diào)節(jié)大豆生長發(fā)育及適應(yīng)干旱脅迫響應(yīng)的過程中發(fā)揮著重要作用。具體研究結(jié)果如下:1、在干旱脅迫處理條件下,大豆葉片相對未處理組變小,大豆miR396家族前體序列(Pre-miR396)的表達(dá)均表現(xiàn)為上調(diào);大豆根相對未處理組變得長而發(fā)達(dá),Pre-miR396的表達(dá)均表現(xiàn)為下調(diào)。2、靶基因預(yù)測結(jié)果顯示,大豆miR396家族基因主要調(diào)控的是GmGRF家族基因,其中26個GmGRF基因家族成員中,有24個GmGRF成員被預(yù)測為是7個Gma-miR396(Gma-miR396a,Gma-miR396b,Gma-miR396c,Gma-miR396e,Gma-miR396h,Gma-miR396i,Gma-miR396k)成熟序列的靶基因,作用位點位于WRC區(qū)保守的“CGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA”序列,對應(yīng)保守的“RSRKPVE”氨基酸位點。對干旱脅迫處理條件下大豆葉片和根中的GmGRF家族基因進(jìn)行表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)GmGRF家族基因的表達(dá)大多與大豆Pre-mi R396表達(dá)變化趨勢相反。3、5’-RACE法檢測到Gma-miR396在GmGRF基因上的剪切位點在“CGUUCAAGAA”與“AGCCUGUGGAA”之間;此外,利用原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化法,證明了上述7個Gma-miR396和24個GmGRF呈現(xiàn)多對多的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系,與預(yù)測結(jié)果一致。4、在擬南芥中分別超表達(dá)大豆miR396家族11個Pre-miR396(a~k)基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn),7個Pre-miR396家族基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥(mi R396a-OE,miR396b-OE,miR396c-OE,miR396e-OE,miR396h-OE,miR396i-OE,miR396k-OE)表現(xiàn)出了植株矮小,葉片變小,根系變短,莢果變小,莢粒減少及生物量降低等表型特征,部分轉(zhuǎn)基因株系出現(xiàn)了莢果和花朵畸形表型。顯微分析發(fā)現(xiàn),它們的葉片細(xì)胞增殖受到了抑制。此外,Gma-miR396d、Gma-miR396f、Gma-miR396g和Gma-miR396j不具有miR396基因家族的典型功能,轉(zhuǎn)基因擬南芥沒有表型出現(xiàn)。5、分析上述7個Pre-miR396轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱能力,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片表現(xiàn)為適應(yīng)干旱的能力增強(qiáng),但種子和根適應(yīng)干旱的能力下降,表現(xiàn)出了抗旱能力的組織差異性。在土壤干旱條件下,miR396a-OE,miR396b-OE,miR396c-OE轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)為抗旱能力降低。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S565.1

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