本文關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒全基因組序列測(cè)定及轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建

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【摘要】：雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬球蟲(chóng)寄生在雞腸道引起的全球性原蟲(chóng)病,每年在世界范圍內(nèi)因雞球蟲(chóng)病造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)8億美元。目前對(duì)雞球蟲(chóng)病的防治主要依賴化學(xué)藥物,但近年來(lái),雞球蟲(chóng)耐藥性的不斷增強(qiáng)以及人們對(duì)藥物殘留危害的逐步重視,使化學(xué)藥物的應(yīng)用受到極大限制。此外弱毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)及擴(kuò)大感染的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)雞球蟲(chóng)病原組成種類繁多,活疫苗生產(chǎn)和監(jiān)測(cè)等環(huán)節(jié)復(fù)雜,使其預(yù)防效果也不盡理想。近年來(lái)基因工程雞球蟲(chóng)疫苗成為研究熱點(diǎn),然而并未在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用。造成這些問(wèn)題的根本原因是對(duì)雞球蟲(chóng)的生物學(xué)特性不明確,因此進(jìn)行雞球蟲(chóng)分子生物學(xué)研究、應(yīng)用有效的基因工程技術(shù)對(duì)雞球蟲(chóng)進(jìn)行基因操作已成為現(xiàn)代雞球蟲(chóng)病防治的重要研究方向。寄生性原蟲(chóng)雙鏈RNA病毒(ds RNA viruses)已經(jīng)在陰道毛滴蟲(chóng)、藍(lán)氏賈第蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)等寄生性原蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)。本研究在長(zhǎng)春地區(qū)病雞盲腸分離得到的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株中(Et611株)經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),存在一種雙鏈RNA病毒類似顆粒(直徑約30納米),并首次測(cè)定該病毒基因組序列,在此基礎(chǔ)上又構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒轉(zhuǎn)染載體。本研究?jī)?nèi)容為雞球蟲(chóng)分子生物學(xué)特征研究提供了新的思路。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒全基因組測(cè)序通過(guò)三步測(cè)序法進(jìn)行柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒基因組測(cè)序,測(cè)定了新發(fā)現(xiàn)的ds RNA病毒基因組序列。測(cè)序結(jié)果顯示,病毒基因組全長(zhǎng)6006bp,包含兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF1長(zhǎng)度為2367bp,ORF2長(zhǎng)度為3216bp),同時(shí)在兩個(gè)開(kāi)放閱讀框的交界處存在五堿基長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)換片段(UGA/UG)。BLASTp分析顯示,柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒與布氏艾美耳球蟲(chóng)病毒氨基酸序列最為接近。該病毒具有全病毒科的各項(xiàng)特征,可認(rèn)定該病毒為全病毒科的一個(gè)新種。本研究測(cè)定的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒基因組是該病毒基因組的首次測(cè)定,依據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)的病毒命名規(guī)則,將此病毒暫命名為E.tenella RNA virus 1(Et RV1)。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒蛋白不同時(shí)期的表達(dá)通過(guò)對(duì)感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的雞盲腸上皮組織(速殖子)、未孢子化卵囊、孢子化卵囊的m RNA和蛋白樣品分別進(jìn)行RT-PCR和Western Blotting分析。結(jié)果顯示Rd Rp蛋白在球蟲(chóng)的三個(gè)不同時(shí)期內(nèi),都獲得了表達(dá);而coat蛋白僅在球蟲(chóng)孢子化過(guò)程中表達(dá)。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒分子進(jìn)化分析為了進(jìn)一步對(duì)該病毒進(jìn)行研究,對(duì)測(cè)得的Et RV1基因組序列和Totiviridae病毒科的全部病毒序列進(jìn)行多重序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。分析結(jié)果表明,柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒和布氏艾美耳球蟲(chóng)病毒與真菌病毒同聚類于Victorivirus屬,而與其它的原蟲(chóng)病毒距離較遠(yuǎn),不在同一分支上,因此艾美耳球蟲(chóng)病毒應(yīng)劃分為一個(gè)新亞屬(Eimeriaviruses subgenus)。球蟲(chóng)病毒與宿主呈現(xiàn)整體協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè),強(qiáng)烈顯示Rd Rp編碼框上游具有獨(dú)立啟動(dòng)子。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒轉(zhuǎn)染載體構(gòu)建在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒序列的測(cè)定及病毒蛋白表達(dá)時(shí)期的研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒載體。將綠色熒光蛋白(e GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)作為報(bào)告基因連綴于病毒序列中。使用電穿孔技術(shù)將含有報(bào)告基因的雙鏈RNA載體轉(zhuǎn)入柔嫩艾美耳球蟲(chóng)未孢子化卵囊。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選純化可發(fā)熒光的柔嫩艾美耳球蟲(chóng),并接種雛雞,進(jìn)行體內(nèi)增殖傳代。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫印記和激光共聚焦掃描試驗(yàn),結(jié)果表明報(bào)告基因GFP、RFP和RFP-GFP在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)傳代的第二代到第四代蟲(chóng)體中均得以表達(dá)。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表達(dá)熒光蛋白的總體比例穩(wěn)定于60%左右。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病毒轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31

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