本文關鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲病毒全基因組序列測定及轉染載體的構建

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【摘要】：雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲寄生在雞腸道引起的全球性原蟲病,每年在世界范圍內因雞球蟲病造成的經濟損失可達8億美元。目前對雞球蟲病的防治主要依賴化學藥物,但近年來,雞球蟲耐藥性的不斷增強以及人們對藥物殘留危害的逐步重視,使化學藥物的應用受到極大限制。此外弱毒活疫苗存在毒力返強及擴大感染的風險,同時雞球蟲病原組成種類繁多,活疫苗生產和監(jiān)測等環(huán)節(jié)復雜,使其預防效果也不盡理想。近年來基因工程雞球蟲疫苗成為研究熱點,然而并未在實際生產中得到應用。造成這些問題的根本原因是對雞球蟲的生物學特性不明確,因此進行雞球蟲分子生物學研究、應用有效的基因工程技術對雞球蟲進行基因操作已成為現(xiàn)代雞球蟲病防治的重要研究方向。寄生性原蟲雙鏈RNA病毒(ds RNA viruses)已經在陰道毛滴蟲、藍氏賈第蟲、利什曼原蟲等寄生性原蟲中發(fā)現(xiàn)。本研究在長春地區(qū)病雞盲腸分離得到的柔嫩艾美耳球蟲蟲株中(Et611株)經試驗發(fā)現(xiàn),存在一種雙鏈RNA病毒類似顆粒(直徑約30納米),并首次測定該病毒基因組序列,在此基礎上又構建了柔嫩艾美耳球蟲病毒轉染載體。本研究內容為雞球蟲分子生物學特征研究提供了新的思路。柔嫩艾美耳球蟲病毒全基因組測序通過三步測序法進行柔嫩艾美耳球蟲病毒基因組測序,測定了新發(fā)現(xiàn)的ds RNA病毒基因組序列。測序結果顯示,病毒基因組全長6006bp,包含兩個開放閱讀框(ORF1長度為2367bp,ORF2長度為3216bp),同時在兩個開放閱讀框的交界處存在五堿基長度的轉換片段(UGA/UG)。BLASTp分析顯示,柔嫩艾美耳球蟲病毒與布氏艾美耳球蟲病毒氨基酸序列最為接近。該病毒具有全病毒科的各項特征,可認定該病毒為全病毒科的一個新種。本研究測定的柔嫩艾美耳球蟲病毒基因組是該病毒基因組的首次測定,依據(jù)國際病毒分類委員會的病毒命名規(guī)則,將此病毒暫命名為E.tenella RNA virus 1(Et RV1)。柔嫩艾美耳球蟲病毒蛋白不同時期的表達通過對感染柔嫩艾美耳球蟲的雞盲腸上皮組織(速殖子)、未孢子化卵囊、孢子化卵囊的m RNA和蛋白樣品分別進行RT-PCR和Western Blotting分析。結果顯示Rd Rp蛋白在球蟲的三個不同時期內,都獲得了表達;而coat蛋白僅在球蟲孢子化過程中表達。柔嫩艾美耳球蟲病毒分子進化分析為了進一步對該病毒進行研究,對測得的Et RV1基因組序列和Totiviridae病毒科的全部病毒序列進行多重序列比對和進化樹構建。分析結果表明,柔嫩艾美耳球蟲病毒和布氏艾美耳球蟲病毒與真菌病毒同聚類于Victorivirus屬,而與其它的原蟲病毒距離較遠,不在同一分支上,因此艾美耳球蟲病毒應劃分為一個新亞屬(Eimeriaviruses subgenus)。球蟲病毒與宿主呈現(xiàn)整體協(xié)同進化關系。通過啟動子區(qū)域預測,強烈顯示Rd Rp編碼框上游具有獨立啟動子。柔嫩艾美耳球蟲病毒轉染載體構建在柔嫩艾美耳球蟲病毒序列的測定及病毒蛋白表達時期的研究的基礎上,構建了柔嫩艾美耳球蟲病毒載體。將綠色熒光蛋白(e GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)作為報告基因連綴于病毒序列中。使用電穿孔技術將含有報告基因的雙鏈RNA載體轉入柔嫩艾美耳球蟲未孢子化卵囊。經流式細胞術分選純化可發(fā)熒光的柔嫩艾美耳球蟲,并接種雛雞,進行體內增殖傳代。通過流式細胞術、免疫印記和激光共聚焦掃描試驗,結果表明報告基因GFP、RFP和RFP-GFP在柔嫩艾美耳球蟲傳代的第二代到第四代蟲體中均得以表達。柔嫩艾美耳球蟲表達熒光蛋白的總體比例穩(wěn)定于60%左右。柔嫩艾美耳球蟲病毒轉染載體的構建為柔嫩艾美耳球蟲分子生物學研究奠定了基礎。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

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