本文關鍵詞：大豆低豐度蛋白的分離、鑒定及其提取物對小鼠的生理效應研究

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【摘要】：在大豆中表達量較少的大豆低豐度蛋白,因受傳統(tǒng)提取方法的限制及檢測時高豐度蛋白的遮蔽作用,使其提取及鑒定成為大豆蛋白質(zhì)組學研究的一大挑戰(zhàn)。因此,本研究對大豆低豐度蛋白的提取方法進了優(yōu)化,并試圖在鑒定提取物成分的基礎上揭示大豆低豐度蛋白提取物對斷奶小鼠的生理功能效應(無大豆高豐度蛋白干擾)。1大豆低豐度蛋白的分離、鑒定本研究探究了異丙醇濃度、超聲功率、超聲時間和總提取時間等因素對大豆低豐度蛋白分離的影響,優(yōu)化了其提取條件,并對最佳條件下的提取物成分通過SDS-PAGE、MS及液相、氣相色譜等方法進行了鑒定。結(jié)果顯示：(1)50%異丙醇去除大豆高豐度蛋白的效果較好,超聲功率400 W、超聲10 min和提取1h(超聲時間+水浴震蕩)分別是大豆低豐度蛋白的最佳提取單因素條件,且超聲處理的作用遠大于總提取時間的。(2)大豆低豐度蛋白提取、富集的最佳條件為：50%異丙醇,超聲功率350 W,超聲15 min,提取1 h。(3)大豆低豐度蛋白提取物中檢測到一些無法通過常規(guī)提取法獲得的低豐度蛋白如磷酸酯-D、β-淀粉酶、16.5 KD油質(zhì)蛋白、無特征大豆蛋白和未知大豆蛋白,且無高豐度蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)和大豆異黃酮,而異丙醇和丙酮的殘留量分別僅為0.0231%和0.0430%。2大豆低豐度蛋白提取物(以下簡稱提取物)對小鼠生長性能的影響選用180只21日齡ICR斷奶小鼠,分成5組(對照和Do.5mg, D1mg,D2mg,D4mg等4個處理組,mg代表灌胃液中的低豐度蛋白量),每組3個重復。飼喂AIN93G標準化小鼠純合日糧1周以適應環(huán)境,28日齡開始灌胃試驗,探究不同劑量提取物對小鼠生長性能的影響。結(jié)果顯示：(1)各試驗期處理組小鼠的體重均高于其對照,且D2mg組最高。(2)除1-7 d外,其他試驗期處理組小鼠的日增重、肉料比和增長率均高于其對照,且D2mg組最高。(3)7 d時,E組小鼠心臟指數(shù)顯著低于對照妒0.05)；28 d時,處理組小鼠心臟、腎臟指數(shù)均高于對照。綜上所述,大豆低豐度蛋白提取物在1-7 d時對小鼠生長有一定抑制作用；隨著試驗期的延長,提取物表現(xiàn)出明顯的促生長效果,且以D2mg組的效果最佳。3提取物對小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響本試驗旨在研究提取物對小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響,試驗動物及分組等同上。結(jié)果顯示：(1)7、14、21 d時的D2mg、D4mg組小鼠血清白細胞、淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞數(shù)目均高于對照,且E組最高。(2)7、28 d時,各試驗組小鼠胸腺指數(shù)均無顯著差異,但各試驗期D2mg組均低于對照；7、14、21 d時的處理組小鼠脾臟指數(shù)與其對照差異不顯著,其中各試驗期D4mg組均高于對照；7、14、21 d時處理組的肝臟指數(shù)低于對照,28 d時均高于對照。(3)各試驗期D2mg組小鼠血清IL-2含量高于對照；7、28 d時各試驗處理組的IL-10、IgG和TNF-α含量與對照相比無顯著差異,且28 d時的D2mg組IL-2、 IgG口]NF-α含量高于其他組；7、28 d(D2mg組除外)時,各試驗處理組小鼠脾臟的IL-2、 TNF-α基因相對表達量均高于對照；28 d時各試驗組間的His、D-乳酸含量無顯著差異,但D2mg組均低于對照,而7 d時高于其對照。(4)28 d時各試驗處理組小鼠血清的T-AOC含量均高于對照,各試驗期Dlmg、D2mg組小鼠血清T-AOC含量高于對照；7 d時各試驗組小鼠肝臟的SOD、CAT和GPX基因相對表達量差異不顯著,28 d時的Dlmg、D2mg組高于對照。以上結(jié)果表明：7 d時,灌胃提取物使小鼠的機體發(fā)生了免疫反應,導致其腸道一定程度受損,但對小鼠抗氧化能力無顯著影響。4提取物對小鼠消化代謝相關血液指標和基因表達的影響本試驗探究了提取物對小鼠消化代謝的影響,試驗動物及分組等同上。結(jié)果顯示：(1)28 d時各試驗組小鼠血清的TC和TG含量無顯著差異,且D 2mg組最低；7、14 d各試驗處理組小鼠血清的Apo-B含量均高于其對照,21、28 d各試驗處理組均低于其對照(28 d時D0 5mg組除外)；7 d時D2mg組小鼠肝臟HMG-CoA、ACS、SREBP-1c和SREBP-2基因相對表達量均低于其他各處理組,28 d時D21ng組小鼠肝臟HMG-CoA、ACS在所有試驗組中最高,而D4mg組SREBP-1c和SREBP-2最高。(2)7、14、21d各試驗組血清GLU含量無顯著差異,28 d時各試驗處理組均高于對照；各試驗期D1mg、D2mg組小鼠血清胰島素水平較高,D4mg組低于對照；7 d時D0.5mg、D1mg組小鼠肝臟PEPCK、GCK基因相對表達量較高,而D2mg、D4mg組較低；28 d時在所有試驗組中,D4mg組PEPCK最低但GCK最高。(3)28 d時的處理組小鼠血清ALB、GLB含量和A/G與對照無顯著差異,7 d時的處理組小鼠血清ALB含量與對照無顯著差異,GLB含量高于對照而A/G低于對照；7 d時的處理組小鼠肝臟ALB基因相對表達量均高于其對照,28 d時的D4mg組低于其他各試驗組。7d時的處理組小鼠血清ALT含量均低于其對照,21、28 d(D0.5mg組ALT除外)均高于其對照�？傊�,提取物通過對小鼠血清胰島素水平、肝臟代謝基因HMG-CoA.ALB和PEPCK表達量等影響改變了小鼠機體糖、脂、蛋白質(zhì)的消化代謝,且尤以D2mg組最為明顯。5提取物對小鼠小腸微生物菌群的影響本試驗通過高通量測序法研究了不同劑量灌胃提取物小鼠的小腸細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和組間相似性。結(jié)果表明：(1)適量(D0.5mg、D1mg、D2mg組)提取物改變了小鼠腸道的微生物區(qū)系,提高了小鼠小腸內(nèi)的微生物豐富度,增加了微生物的多樣性。(2)在門的水平上,厚壁菌門(83.15% -91.96%)、藍菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門；在屬的水平上,鏈球菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳酸球菌屬、Allobaculum、Chloroplast等為優(yōu)勢菌屬。(3)試驗D2mg組乳酸菌(乳酸桿菌和乳酸球菌之和)屬所占比例最高,比對照提高25.11%,其中乳酸桿菌屬所占比例顯著高于D0.5mg、D4mg(P0.05)。(4)各試驗組共享1620個OTU,占細菌總OTU數(shù)目的10.53%；Unifrac主坐標分析結(jié)集也表明不同試驗組小腸微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異,且同組個體之間也具有較大差異。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S816

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