本文關(guān)鍵詞：紫黑翼蚌養(yǎng)殖基礎(chǔ)生物學(xué)特性與鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育研究

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【摘要】：淡水蚌類是指軟體動(dòng)物門、雙殼綱、蚌目的種類,它們起源于大約1億年前,在漫長(zhǎng)的進(jìn)化演變過(guò)程中形成了豐富的生態(tài)和物種多樣性。目前,現(xiàn)存的淡水蚌類約840種,除南極地區(qū)外世界各個(gè)地區(qū)均有分布。它們不僅在維護(hù)淡水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用,而且自遠(yuǎn)古時(shí)代就為人們所利用,具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,主要包括食用、工藝品和培育珍珠等。紫黑翼蚌(紫黑翼蚌(Potamilus alatus )原產(chǎn)于北美洲,隸屬于蚌科、Lampsilinae亞科,為大型淡水貝類。在天然水域中紫黑翼蚌能產(chǎn)生天然的紫黑珍珠,人工插珠試驗(yàn)表明:紫黑翼蚌是培育優(yōu)質(zhì)紫黑珍珠的優(yōu)良品種。為在我國(guó)發(fā)展紫黑珍珠養(yǎng)殖,2012年淡水漁業(yè)研究中心從美國(guó)引進(jìn)一批紫黑翼蚌幼蚌,在國(guó)內(nèi)開展人工馴養(yǎng)研究。由于紫黑翼蚌在北美為穩(wěn)定物種,基礎(chǔ)生物學(xué)研究甚為薄弱,且尚未有人工養(yǎng)殖,這給我國(guó)開展人工馴養(yǎng)帶來(lái)極大困難。另一方面,紫黑翼蚌鉤介幼蟲需要寄生在特定的寄主魚——淡水石首魚(Aplodinotus grunnens)才能完成寄生變態(tài)發(fā)育,從而實(shí)現(xiàn)苗種的人工繁育。由于國(guó)內(nèi)沒(méi)有淡水石首魚,嚴(yán)重制約了我國(guó)紫黑翼蚌苗種的人工繁育和紫黑珍珠產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)程。本文以引進(jìn)的紫黑翼蚌幼蚌開展養(yǎng)殖基礎(chǔ)生物學(xué)特性與鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育研究,為實(shí)現(xiàn)紫黑翼蚌人工養(yǎng)殖與繁育提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐,對(duì)我國(guó)淡水珍珠養(yǎng)殖品種結(jié)構(gòu)調(diào)整和可持續(xù)發(fā)展具有重要價(jià)值和意義。本研究主要包括以下6個(gè)部分:1紫黑翼蚌在人工養(yǎng)殖條件下的生長(zhǎng)與形態(tài)特征在ISC模式下,1 ～ 3齡紫黑翼蚌體重生長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯周年季節(jié)變化特征,4～10月為快速生長(zhǎng)期,11月～奕年3月為緩慢增長(zhǎng)期,呈現(xiàn)明顯的“快-慢”交替規(guī)律;在1～2齡階段,殼長(zhǎng)、殼高及殼寬生長(zhǎng)趨勢(shì)與體重相似,而2～3齡階段均為平緩生長(zhǎng)期;貝殼存在一定的異速生長(zhǎng),2齡殼寬增長(zhǎng)率最高,3齡殼高增長(zhǎng)率最高。Logistic模型為紫黑翼蚌殼長(zhǎng)生長(zhǎng)的最佳擬合模型。比較了兩種養(yǎng)殖模式對(duì)紫黑翼蚌成活和生長(zhǎng)的影響。在SPC模式下,15個(gè)月馴養(yǎng)成活率(98.6 ± 2.9% )顯著高于ISC模式(85.0 ± 5.0% );自2齡起,SPC組蚌平均體重、殼長(zhǎng)、殼高、殼寬及月增長(zhǎng)率均顯著高于ISC組;紫黑翼蚌馴養(yǎng)死亡主要出現(xiàn)在6～8月高溫期間,可能是高水溫與高氨氮及亞硝酸鹽等協(xié)同作用結(jié)果;紫黑翼蚌適宜的生長(zhǎng)水溫為18.7 ～31.5℃C,且對(duì)低溫有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。通過(guò)個(gè)體標(biāo)記跟蹤比較了紫黑翼蚌雌雄形態(tài)和生長(zhǎng)差異,結(jié)果表明:兩性異形和體重、殼長(zhǎng)、殼高及殼寬差異均出現(xiàn)在2齡初次性成熟前后;雌蚌雙殼后端逐步變寬直而膨脹,可能有利于育兒囊內(nèi)胚胎的發(fā)育。在SPC模式下,2齡雄蚌體重、殼長(zhǎng)分別高于雌蚌41.5%、16.7%,3齡雄蚌分別高44.0%、15.1%,雄蚌更適宜作為紫黑珍珠培育的受體蚌;兩種養(yǎng)殖模式對(duì)雌雄形態(tài)分化影響不大,對(duì)雌雄體重和殼長(zhǎng)生長(zhǎng)差異表現(xiàn)時(shí)間無(wú)顯著影響,但在ISC模式下雌雄殼高、殼寬出現(xiàn)差異的時(shí)間延遲。2紫黑翼蚌幼蚌足絲分泌特性與微結(jié)構(gòu)研究與我國(guó)淡水蚌類不同,紫黑翼蚌在幼蚌早期生長(zhǎng)階段能分泌形成暫時(shí)性足絲。在殼長(zhǎng)5 ～ 30mm階段,隨著殼長(zhǎng)增長(zhǎng),分泌足絲的幼蚌比例逐步下降,而殼長(zhǎng)30mm以上的幼蚌停止分泌。底質(zhì)類型顯著影響幼蚌足絲分泌,但足絲分泌速率存在明顯的個(gè)體差異。對(duì)足絲微結(jié)構(gòu)觀察顯示:足絲主要由足絲線、足絲柄及足絲盤組成。若干足絲盤通過(guò)足絲柄沿足絲線隨機(jī)鏈接分布。足絲線外部由一層均質(zhì)的足絲膜覆蓋,內(nèi)部由4股初級(jí)纖維形成右手螺旋結(jié)構(gòu),而初級(jí)纖維由大量平行排列的直徑5μm的二級(jí)纖維組成。足絲盤底部具有較高的粘性,在水下可牢固粘附在砂礫等底質(zhì)上。當(dāng)受到外力拉伸后,足絲線可發(fā)生較大的彈性形變,但足絲膜先于內(nèi)部纖維發(fā)生斷裂。幼蚌的足絲與海水貽貝足絲的微結(jié)構(gòu)和氨基酸組成均存在顯著差異,其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)在早期幼蚌的生存、遷移和聚集上具有重要作用。本研究首次報(bào)道了紫黑翼蚌的暫時(shí)性足絲分泌特性和微結(jié)構(gòu),并探討了與生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系,為進(jìn)一步開展早期幼蚌規(guī)�；嘤峁┲匾碚撘罁�(jù)。3人工養(yǎng)殖紫黑翼蚌的繁殖生物學(xué)研究在江蘇地區(qū)紫黑翼蚌養(yǎng)殖種群在2齡達(dá)到初次性成熟,未發(fā)現(xiàn)明顯的性別偏離。9月早期至10月份為雌雄蚌交配盛期,在10月初即可達(dá)到成熟,而自然排放主要在翌年4 ～ 5月份,為長(zhǎng)期孵育類型(Bradytictic )。雌蚌性成熟最小殼長(zhǎng)58.5 mm ,懷幼量在2860 ～ 37400 ,與養(yǎng)殖模式及母蚌的體重等密切相關(guān),但顯著少于我國(guó)常見(jiàn)的大型蚌類的懷幼量。在人工養(yǎng)殖條件下,紫黑翼蚌的繁殖周期與阿拉巴馬州的野生種群相似,而與更高緯度的威斯康辛州野生種群有較大差異,這可能主要與生長(zhǎng)發(fā)育的積溫差異有關(guān)。紫黑翼蚌受精卵為長(zhǎng)橢圓形,隨著胚胎發(fā)育時(shí)序,卵黃囊逐步被胚體吸收而縮小,(?)胚體逐步增大,但胚體并不包裹卵黃囊吸收營(yíng)養(yǎng),這種特殊的營(yíng)養(yǎng)供給方式與我國(guó)的蚌類完全不同。依據(jù)卵黃囊的大小、胚體形態(tài)及運(yùn)動(dòng)等顯著發(fā)育特征,將原先統(tǒng)稱為鉤介幼蟲期進(jìn)一步劃分為肌肉效應(yīng)期、閉殼肌形成期、雙殼成形期、雙殼開合期及破膜期。形態(tài)學(xué)觀察表明:成熟鉤介幼蟲為斧頭型,雙殼左右對(duì)稱,但大小略有差異;腹緣具有2對(duì)膠質(zhì)的殼鉤和成排的乳突,在幼蟲寄生過(guò)程中具有重要作用;外套膜游離面為柱狀細(xì)胞,內(nèi)部具有3對(duì)左右對(duì)稱分布的感覺(jué)毛,1對(duì)位于近腹緣,2對(duì)分別位于閉殼肌附近。4紫黑翼蚌母系與父系線粒體基因組比較及系統(tǒng)發(fā)育分析基因擴(kuò)增表明:紫黑翼蚌體內(nèi)存在兩類完全不同線粒體,為明顯的單雙親遺傳(DUI )。母系(F型)線粒體基因組長(zhǎng)度為16 067bp ,父系(M型)為16 560bp,比F型長(zhǎng)493bp。兩類線粒體均含有37個(gè)常規(guī)基因。在F型和M型線粒體中分別發(fā)現(xiàn)1個(gè)雌性開放閱讀框(forf)和雄性開放閱讀框(morf);基因組均具有明顯的(A+T )堿基偏向(F = 61% , M = 62.2% )。 37個(gè)基因排序差異主要是tRNAs與兩個(gè)ORFan基因的位置存在較大不同。M型線粒體基因具有144 bp的cox2延長(zhǎng)(cox2e ),顯著短于已報(bào)道的蚌類531～～576bp差異,這種較短的Mcox2e可能是Potamilus屬物種線粒體基因組的共同進(jìn)化特征。以23個(gè)蚌類線粒體基因組序列(包括紫黑翼蚌)重建了其系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明:蚌類F型和M型為并系,進(jìn)化關(guān)系顯示:DUI起源先于蚌科的物種形成之前,也先于蚌科和珠蚌科物種分化;紫黑翼蚌與Leptodealeptodon的親緣關(guān)系更為接近,這與兩者具有十分相似的生物學(xué)特性相吻合。已有近緣種的生物學(xué)研究也對(duì)我國(guó)紫黑翼蚌的人工養(yǎng)殖和繁育具有重要參考價(jià)值。5紫黑翼蚌鉤介幼蟲寄主魚的人工篩選選取16種代表性魚類對(duì)紫黑翼蚌鉤介幼蟲寄主魚進(jìn)行人工篩選試驗(yàn)結(jié)果表明:僅在淡水石首魚上獲得變態(tài)發(fā)育的稚蚌,寄生變態(tài)率為49.6% ,過(guò)量寄生可能是導(dǎo)致淡水石首魚死亡的重要原因。掃描電鏡觀察顯示:鉤介幼蟲可在眼斑擬石首魚鰓絲寄生并形成完整的包囊,且在大規(guī)格魚體形成包囊的速度明顯快于幼魚,表明眼斑擬石首魚具有用作替代寄主魚的潛力;但在寄生和淡水低滲雙重脅迫下,眼斑擬石首魚寄生后出現(xiàn)極高的死亡率,應(yīng)進(jìn)一步開展淡化處理和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化培育,提高其寄生魚的暫養(yǎng)成活率。與其他魚類相比,在黃顙魚、小口鱸魚、藍(lán)鯰魚寄生后1～2d內(nèi)脫落的幼蟲幾乎全部死亡,推測(cè)3種魚體中可能存在紫黑翼蚌幼蟲的致死因子,這與后期的黃顙魚血漿對(duì)幼蟲的體外培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果相符。綜合結(jié)果表明:紫黑翼蚌是目前發(fā)現(xiàn)對(duì)寄主魚選擇性最為專一的蚌類。6紫黑翼蚌鉤介幼蟲的非寄生變態(tài)發(fā)育研究比較了改進(jìn)的體外培養(yǎng)技術(shù)和傳統(tǒng)方法對(duì)紫黑翼蚌鉤介幼蟲非寄生變態(tài)發(fā)育的影響。進(jìn)一步以改進(jìn)的體外培養(yǎng)技術(shù),從14種血漿(或血清)中篩選出了紫黑翼蚌鉤介幼蟲體外培養(yǎng)高效配方,首次成功實(shí)現(xiàn)斧頭型鉤介幼蟲的非寄生變態(tài)發(fā)育。結(jié)果表明:添加不同血漿(血清)對(duì)紫黑翼蚌的鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育具有顯著差異,黃顙魚、大口黑鱸、大鱗渻、雜交鱘及兔血清組幼蟲全部死亡,而其他9組幼蟲培養(yǎng)20d的成活率在12.4% ～ 98.3%之間,僅瓜子斑和眼斑擬石首魚組能使幼蟲完成變態(tài)發(fā)育,瓜子斑組幼蟲變態(tài)率最高(93.3 ± 3.1% ),顯著高于海水與淡化眼斑擬石首魚組。不同孕育時(shí)期的孕育蚌幼蟲變態(tài)率存在顯著差異,變態(tài)率所孵育時(shí)間增加而逐步下降,可能與孕育蚌的營(yíng)養(yǎng)供給有關(guān)。2倍傳統(tǒng)混合抗生素濃度對(duì)幼蟲變態(tài)發(fā)育具有明顯抑制和致死作用,表明紫黑翼蚌對(duì)混合抗生素較為敏感。添加不同比例瓜子斑和鯉魚混合血漿對(duì)幼蟲變態(tài)發(fā)育具有明顯差異:隨著鯉魚血漿添加比例增加,幼蟲變態(tài)率、稚蚌活力顯著下降,而外殼生長(zhǎng)速度和稚蚌畸形發(fā)育比例明顯增加;保存11月與新制備的瓜子斑血漿對(duì)幼蟲變態(tài)率無(wú)顯著差異,但前者變態(tài)畸形率顯著升高(P=0.003) 其畸形稚蚌與鯉魚組相似。表明鯉魚血漿中存在促進(jìn)幼蟲外殼生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)因子,而缺乏促進(jìn)幼蟲內(nèi)臟發(fā)育的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)因子;瓜子斑血漿中存在較高含量促進(jìn)幼蟲內(nèi)臟包括斧足發(fā)育的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)因子,且隨著凍存時(shí)間會(huì)明顯下降。在添加瓜子斑血漿的培養(yǎng)液中,24℃條件下,幼蟲在20d完成變態(tài)發(fā)育成稚蚌。在變態(tài)發(fā)育過(guò)程中,不僅要完成內(nèi)臟組織器官的分化,其外殼增長(zhǎng)約2～3倍,為內(nèi)臟器官的分化與生長(zhǎng)提供了更大的空間。在培養(yǎng)早期,幼蟲外套膜細(xì)胞逐步增厚形成蘑菇體細(xì)胞,使雙殼封閉;新殼從前后端逐步生長(zhǎng)成近圓形;在培養(yǎng)中期至后期,內(nèi)部斧足板、鰓板、內(nèi)臟組織及閉殼肌等逐步形成,最終變態(tài)形成依靠斧足自由爬動(dòng)的稚蚌。對(duì)血漿主要生化指標(biāo)測(cè)定分析表明:與其他魚類相比,瓜子斑血漿具有低血糖和甘油三酯、高蛋白、膽固醇和脂蛋白的特點(diǎn),可能是幼蟲具有高變態(tài)率的重要原因。進(jìn)一步對(duì)FAA比較測(cè)定分析表明:常見(jiàn)20種氨基酸雖有一定差異,但與L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)液相比,其含量極低,對(duì)培養(yǎng)液配方中含量無(wú)顯著影響。鯉魚血漿的�；撬岷匡@著高于其他3種魚類,分別是瓜子斑的9.1倍、眼斑擬石首魚的3.6倍。高濃度的�；撬崾俏ㄒ豢赡艽龠M(jìn)幼蟲外殼快速生長(zhǎng)的氨基酸因子。對(duì)血漿脂肪酸組成比較分析推測(cè):培養(yǎng)液中缺乏足夠量的DPA和DHA可能是紫黑翼蚌幼蟲斧足及內(nèi)臟異常發(fā)育的重要原因之一。黃顙魚、大鱗渻血漿熱滅活處理后對(duì)幼蟲變態(tài)發(fā)育具有明顯影響。未滅活組幼蟲在培養(yǎng)24h全部開口腐爛死亡,而黃顙魚、大鱗渻血漿滅活組幼蟲在培養(yǎng)10d存活率分別為82%、55% ,且黃顙魚漿滅活組外殼生長(zhǎng)明顯,而大鱗渻組幼蟲外殼生長(zhǎng)差異較大。對(duì)比黃顙魚、大鱗渻、瓜子斑及眼斑擬石首魚血漿滅活前后的8種非特異性免疫指標(biāo)變化,結(jié)果表明血漿中溶菌酶、干擾素、補(bǔ)體C3、C4、IgG、IgM、α-HBDH及ALP并非是幼蟲的致死因子。這種紫黑翼蚌幼蟲致死因子可能普遍存在魚體中,可能是魚類對(duì)蚌類鉤介幼蟲寄生的第一道天然防御屏障。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4
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本文編號(hào)：1288364