發(fā)布時(shí)間：2017-12-13 18:36

  本文關(guān)鍵詞：獨(dú)腳金內(nèi)酯在甜瓜抗列當(dāng)機(jī)理和對(duì)列當(dāng)種子萌發(fā)調(diào)控的研究

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【摘要】：研究目的為了明確甜瓜獨(dú)腳金內(nèi)酯合成相關(guān)的兩個(gè)關(guān)鍵基因Cm CCD7和Cm CCD8在獨(dú)腳金內(nèi)酯合成中的作用,以及這兩個(gè)基因沉默后甜瓜對(duì)埃及列當(dāng)(Phlipanche aegyptiaca)種子萌發(fā)率的影響情況。同時(shí)為了明確預(yù)培養(yǎng)處理和獨(dú)腳金內(nèi)酯誘導(dǎo)后列當(dāng)種子萌發(fā)相關(guān)功能基因的表達(dá)變化。最終為埃及列當(dāng)?shù)姆乐翁峁├碚撆c技術(shù)依據(jù)。研究方法通過對(duì)其他植物的獨(dú)腳金內(nèi)酯合成相關(guān)的CCD7和CCD8基因序列分析,依據(jù)這兩個(gè)基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,通過PCR擴(kuò)增甜瓜上這兩個(gè)基因的保守區(qū)段,再通過RACE技術(shù)獲取其側(cè)翼序列。通過ORF finder預(yù)測(cè)這兩個(gè)基因的ORF、DNAMAN分析核酸信息、Proprarm預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、Antheprot預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)、SWISSMODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)、BLASTN進(jìn)行同源比對(duì)并用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。分別對(duì)不同日齡甜瓜子葉,不同激素、不同激素濃度對(duì)甜瓜子葉的分化能力試驗(yàn),最后測(cè)試甜瓜子葉對(duì)Cef和Kan兩種抗生素的耐受能力以及對(duì)不定芽伸長、生根培養(yǎng)基的篩選。選取Cm CCD7和Cm CCD8基因的特異性片段,構(gòu)建反向重復(fù)序列的RNAi植物表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將這兩個(gè)載體轉(zhuǎn)化甜瓜植株。對(duì)獲得的RNAi植株進(jìn)行PCR和Southern雜交驗(yàn)證。對(duì)RNAi植株的IAA、ABA含量利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)收集、濃縮、純化甜瓜根系分泌物,用UPLC-MS/MS對(duì)5-deoxystrigol含量測(cè)定。最后對(duì)RNAi甜瓜植株的分枝情況、列當(dāng)寄生數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。選取休眠種子、預(yù)培養(yǎng)后的種子和GR24處理后的列當(dāng)種子,提取RNA、構(gòu)建測(cè)序文庫進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證、篩選和統(tǒng)計(jì);并對(duì)獲得的Unigenes在NR、Swissprot、GO、COG、KOG和KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋。對(duì)差異基因信息GO功能分析、KEGG代謝通路分析。對(duì)儲(chǔ)存物質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)合成代謝相關(guān)基因進(jìn)行了分析。最后,對(duì)激素合成代謝的相關(guān)基因進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證和分析,并對(duì)相應(yīng)的激素水平進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果甜瓜Cm CCD7和Cm CCD8基因的c DNA全長分別為2346 bp和2153 bp,分別包含了長度為1833 bp(KF381339.1)和1656 bp(KJ473491.1)的開放閱讀框。Cm CCD7和Cm CCD8在甜瓜“黃旦子”的根、莖、葉、芽中均有表達(dá),其中以根中的表達(dá)量最高,芽中最少。整體進(jìn)行對(duì)比后,Cm CCD8基因的相對(duì)表達(dá)量都要高于Cm CCD7基因。Cm CCD7和Cm CCD8編碼的蛋白質(zhì)分子量分別為68.60 k D和61.24 k D。Cm CCD7和Cm CCD8蛋白與己知蛋白質(zhì)RPE65的三級(jí)結(jié)構(gòu)有較高的同源性。兩天葉齡子葉為最佳外植體,分化率最高。而且,不定芽的分化主要發(fā)生在臨近下胚軸子葉基部一側(cè)的傷口邊緣。6-BA與IAA濃度比值越大,越有利于不定芽的分化;6-BA濃度為1.2 mg/l時(shí),誘導(dǎo)效率相對(duì)較高。在不含激素的MS培養(yǎng)基中外植體基部產(chǎn)生許多不定根。在不同濃度范圍的Cef下,不定芽的誘導(dǎo)率并無顯著差異,而且濃度500 mg/l的Cef對(duì)農(nóng)桿菌生長抑制效果較好,因此,以500 mg/l為最佳濃度用于侵染后的脫菌和抑菌過程。在Kan濃度達(dá)到100 mg/l時(shí),子葉不能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽,故將Kan篩選壓力定為100 mg/l。進(jìn)行PCR和Southern雜交檢測(cè)后,分別成功獲得13和8轉(zhuǎn)基因植株。挑取RNAi-Cm CCD7和RNAi-Cm CCD8單克隆植株各一株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。RNAi植株的分枝數(shù)和IAA的水平與非轉(zhuǎn)基因的植株的分枝數(shù)量和IAA水平都非常接近。ABA在非轉(zhuǎn)基因和rnai-73植株中顯著高于比rnai-84植株中。但是并沒有檢測(cè)到5-deoxystrigol,即使是在非轉(zhuǎn)基因甜瓜中。無論是野生型還是RNAi植株列當(dāng)寄生率都非常高,平均每株植株有100個(gè)列當(dāng)寄生。但rnai-84植株上的列當(dāng)寄生率比rnai-73和野生型植株的顯著降低。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共得到19.79Gb Clean數(shù)據(jù),各樣品Q30堿基百分比均大于88.36%。在各核酸數(shù)據(jù)庫中注釋到53,921條Unigenes。經(jīng)過RT-PCR驗(yàn)證后,對(duì)差異基因分析發(fā)現(xiàn),其中休眠種子和預(yù)培養(yǎng)種子中的顯著差異基因有694個(gè),預(yù)培養(yǎng)種子和GR24處理后的種子中的顯著差異表達(dá)基因有4,630個(gè)。對(duì)三個(gè)樣品中的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析,將這些差異表達(dá)基因劃分到9個(gè)Cluster中。三個(gè)不同萌發(fā)階段的差異基因參與了96個(gè)代謝通路。在預(yù)培養(yǎng)階段有GA和BR合成的相關(guān)基因被激活,且兩種激素的含量也同時(shí)升高,與基因表達(dá)情況一致。從轉(zhuǎn)錄組注釋的數(shù)據(jù)中找到了3個(gè)與獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)接收相關(guān)的基因,MAX2和2個(gè)KAI2-like基因。分析后發(fā)現(xiàn),萌發(fā)刺激物受體的相關(guān)基因已經(jīng)在這個(gè)階段得到表達(dá)。在GR24處理后,GA、ABA、乙烯和BRs合成代謝的許多相關(guān)基因也發(fā)生了顯著變化,而且這些變化與其含量的變化一致。在不同激素處理試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)氟啶酮這種類胡蘿卜素合成抑制劑可以刺激列當(dāng)種子的萌發(fā),其可能是抑制了ABA的合成而起作用的。結(jié)論在甜瓜上克隆了與獨(dú)腳金內(nèi)酯合成的兩個(gè)關(guān)鍵基因Cm CCD7和Cm CCD8,并通過RNAi的方法獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株,發(fā)現(xiàn)Cm CCD7和Cm CCD8對(duì)甜瓜抗列當(dāng)?shù)淖饔貌皇呛苊黠@。通過對(duì)列當(dāng)種子萌發(fā)不同階段轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),預(yù)培養(yǎng)階段對(duì)列當(dāng)種子的主要作用可能是誘導(dǎo)GA的合成而不是激活獨(dú)腳金內(nèi)酯受體,GR24的作用可能主要是通過調(diào)節(jié)ABA的合成代謝來促使列當(dāng)種子萌發(fā)。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S453

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1286201