發(fā)布時間：2017-12-12 04:26

  本文關(guān)鍵詞：重組口蹄疫病毒VP1基因的布魯氏菌病活疫苗的構(gòu)建及其生物學(xué)活性研究

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【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,以下簡稱布病),是一種嚴(yán)重威脅人類健康的動物源性人畜共患病。動物感染后導(dǎo)致繁殖能力和生產(chǎn)性能下降,經(jīng)濟損失巨大。我國預(yù)防牛、羊布病主要使用的是布病活疫苗Brucella suis Stain 2株(B.suis S2株),該疫苗在使用過程中無法區(qū)分疫苗免疫與自然感染抗體,給該病的流行病學(xué)調(diào)查和臨床血清學(xué)診斷等造成了困難。口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的牛、羊等的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。VP1蛋白是FMDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,也是病毒感染細胞的關(guān)鍵,具有與細胞受體結(jié)合的位點,所以VP1基因是研制基因工程疫苗的首選靶抗原。本研究以我國廣泛使用的布病活疫苗B.suis S2株為親本株,利用蔗糖自殺質(zhì)粒載體,將FMDV的VP1基因表達框部分替代了布魯氏菌wbo A基因,成功構(gòu)建了重組口蹄疫病毒VP1基因的布魯氏菌病活疫苗。首先,以布病活疫苗B.suis S2株基因組為模板,利用含氯霉素抗性載體分段缺失了wbo A基因,體外活力實驗篩選了6個分段缺失重組菌的活力。然后,構(gòu)建了包含wbo A基因的上、下游同源臂、VP1基因表達框和蔗糖負篩選基因的重組穿梭質(zhì)粒p UC-wbo A-/VP1+,電轉(zhuǎn)化進布病活疫苗B.suis S2株感受態(tài)細胞中,利用氨芐抗性基因(Amp+)和蔗糖負篩選基因(Sac B-)篩選得到陽性重組菌,經(jīng)PCR和測序鑒定,命名為S2?wbo A/VP1株,進一步開展重組疫苗的生物學(xué)特性研究,結(jié)果如下:(1)表型鑒定:熱凝集試驗、吖啶黃試驗和菌落結(jié)晶紫染色試驗結(jié)果證明,重組疫苗S2?wbo A/VP1株的表型為粗糙型,表明親本株部分缺失了wbo A基因后布魯氏菌表型從光滑型改變?yōu)榇植谛汀?2)安全性評價:以不同劑量的重組疫苗分別注射小鼠和牛,通過直腸測溫、采食情況和病理組織學(xué)觀察等結(jié)果均證明重組疫苗具有良好的安全性。(3)口蹄疫VP1基因的鑒定和體液免疫研究:將VP1基因進行原核表達,制備抗血清與重組疫苗進行Western Blot分析,結(jié)果表明VP1在重組疫苗中成功表達,具有免疫反應(yīng)原性。用地高辛探針標(biāo)記VP1基因進行Southern雜交結(jié)果顯示,重組疫苗與親本株相比VP1基因已經(jīng)成功插入布魯氏菌基因組。間接ELISA實驗證實,與親本株不同,重組疫苗免疫組小鼠14d檢測到VP1基因抗體產(chǎn)生,第二次免疫后抗體水平呈快速增加趨勢。(4)布魯氏菌病免疫原性研究:重組疫苗的抗血清與不同表型布魯氏菌菌株的凝集實驗結(jié)果表明,重組疫苗與粗糙型菌株B.melitensis M111株和B.canine RM6/66株呈陽性反應(yīng),與其他光滑型菌株呈陰性反應(yīng)。以小鼠為動物模型,通過脾臟稱重和細菌分離實驗研究重組疫苗在小鼠體內(nèi)的存活時間。結(jié)果表明,免疫后14d重組疫苗小鼠脾臟重量高于親本株,與對照組差異顯著(P0.05)。免疫后42d,疫苗株幾乎不能引起小鼠脾臟腫大,與對照組差異不顯著(P0.05),脾臟中分離不到細菌。用微量試管凝集實驗方法研究抗體消長規(guī)律,結(jié)果表明免疫后7d即可檢測到布魯氏菌抗體,從第7d~14d抗體顯著增加,第14d~28d抗體繼續(xù)增長,但趨勢緩慢,到第42d抗體呈降低趨勢。細胞因子檢測試驗結(jié)果表明,重組疫苗與親本株免疫小鼠后產(chǎn)生的細胞免疫反應(yīng)增長趨勢基本一致,免疫后第7d開始產(chǎn)生IFN-γ,第7d~28d IFN-γ值持續(xù)增加,28d后IFN-γ水平呈下降趨勢。小鼠攻毒保護實驗結(jié)果表明,重組疫苗1×109CFU/只免疫組可以對羊種B.meltensis M28強毒株攻擊提供100%的保護。以羊為動物模型進行攻毒保護試驗,羊的脾臟和腹股溝淋巴結(jié)細菌分離結(jié)果表明,1×1011 CFU/只免疫組感染強毒后有2/10只分離到強毒菌,免疫保護率為80%,與1×1010 CFU/只親本株提供相似的免疫保護率(80%)。由于布病和口蹄疫是兩種感染牛、羊的重要家畜傳染病,布魯氏菌疫苗作為載體能有效提供對目的基因編碼蛋白的細胞免疫作用。因此,本研究構(gòu)建并鑒定的重組口蹄疫VP1基因的布魯氏菌活疫苗為實現(xiàn)對布病和口蹄疫的雙重免疫提供候選疫苗株。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

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本文編號：1281177