本文關(guān)鍵詞：基于免疫磁泳的病原微生物分離與富集技術(shù)研究

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【摘要】：近年來,高致病性禽流感病毒和食源性致病菌等病原微生物時常引起動物疫病和食品中毒,不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且嚴(yán)重威脅了人類的公共衛(wèi)生安全。有效預(yù)防和控制動物疫病和食物中毒的一個關(guān)鍵在于病原微生物的快速篩查,通常包括樣品采集、樣品前處理和微生物檢測等步驟。樣品采集通�？刹捎脟覙�(biāo)準(zhǔn)方法,微生物快速檢測也可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、側(cè)向流動免疫分析(Strip)、生物傳感器(Biosensor)等傳統(tǒng)或新型方法。然而,動物和食品樣品均比較復(fù)雜,通常需要進(jìn)行有效的樣品前處理才能得到準(zhǔn)確可靠的檢測結(jié)果,但是現(xiàn)有的過濾和離心等傳統(tǒng)方法分別是基于大小和重量,均沒有特異性,在微生物樣品前處理存在較大的局限性。雖然免疫磁分離方法可特異性分離并低倍數(shù)富集目標(biāo)微生物,但由于動物和食品樣品中微生物濃度通常較低,故傳統(tǒng)的免疫磁分離也很難滿足動物疫病和食品安全中病原微生物的樣品前處理。因此,本文旨在基于免疫磁分離方法,結(jié)合芯片實(shí)驗(yàn)室和3D打印技術(shù),研究開發(fā)一種用于大體積生物樣品中少量目標(biāo)微生物特異分離和高效富集的免疫磁泳方法及裝備,并以禽流感病毒H5N1和大腸桿菌0157:H7為研究模型開展系統(tǒng)參數(shù)優(yōu)化和性能評價。開展的主要研究工作包括:(1)根據(jù)磁性物質(zhì)在磁泳過程的受力和運(yùn)動分析,通過理論推導(dǎo)、仿真計算、實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計和儀器測定,建立了免疫磁泳動態(tài)模型。首先,利用COMSOL軟件仿真設(shè)計了梯度磁場,分析得到了磁場強(qiáng)度和梯度的空間分布函數(shù)。然后,利用蒙特卡洛方法,分析模擬不同濃度和粒徑磁珠在磁場狀態(tài)下的成鏈狀態(tài),并利用熒光修飾磁珠進(jìn)行驗(yàn)證。最后,根據(jù)磁珠磁泳受力和運(yùn)動分析,建立了磁珠磁泳動態(tài)模型。(2)根據(jù)免疫磁泳動態(tài)模型,通過軌跡仿真和3D打印,建立H5N1禽流感病毒的免疫磁泳分離方法。首先,利用磁泳動態(tài)模型,仿真繪制磁病毒的磁泳運(yùn)動軌跡,并優(yōu)化設(shè)計磁泳分離芯片。然后,利用3D打印技術(shù)制作磁泳芯片,利用高強(qiáng)度NdFeB永磁體構(gòu)建梯度磁場,利用高精度蠕動泵實(shí)現(xiàn)流體自動控制。最后,對流體速度、磁珠濃度和磁珠粒徑等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,并以滅活的禽流感病毒H5N1為研究模型,以血凝測試為病毒檢測方法,開展系統(tǒng)性能測試,結(jié)果表明該方法可在載流體流速不大于120μL/min的條件下實(shí)現(xiàn)88%以上的病毒分離效率。(3)根據(jù)免疫磁泳動態(tài)模型,通過軌跡仿真、3D打印和主動式混合,建立大腸桿菌0157:H7的免疫磁泳分離方法。首先,利用磁泳動態(tài)模型,仿真繪制磁細(xì)菌的磁泳運(yùn)動軌跡,并結(jié)合磁攪拌混合器,優(yōu)化設(shè)計磁泳分離芯片。然后,利用3D打印技術(shù)制作磁泳芯片,利用直流電機(jī)驅(qū)動磁鐵產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)磁場,實(shí)現(xiàn)了磁攪拌混合。最后,對流體速度、磁珠濃度和磁珠粒徑等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,并以大腸桿菌0157:H7為研究模型,以平板計數(shù)為細(xì)菌檢測方法,開展系統(tǒng)性能測試,結(jié)果表明該方法可在載流體流速不大于100μL/min和磁攪拌混合時間為20 min的條件下可實(shí)現(xiàn)87%的細(xì)菌分離效率。本文針對動物防疫和食品安全中病原微生物樣品前處理的實(shí)際需求,基于免疫磁分離技術(shù),提出了磁泳動態(tài)模型,建立了一種可連續(xù)流動分離大體積樣品中目標(biāo)微生物的免疫磁泳方法,并利用禽流感病毒和大腸桿菌進(jìn)行了方法驗(yàn)證,可為病原微生物快速檢測提供一種高富集倍數(shù)的特異分離方法及裝備支持。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.6;R155.5

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本文編號：1273380