發(fā)布時間：2017-12-10 05:23

  本文關(guān)鍵詞：賈第蟲病毒microRNA克隆及功能研究

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【摘要】：賈第蟲是一個原始的真核生物,同時也是一個重要的人獸共患病病原,具有重要的進化生物學研究價值,賈第蟲作為模式生物仍然有很多問題需要解決。賈第蟲病毒是由一個線形的末端開放的7.0 Kb ds RNA和100 KDa的衣殼蛋白組成。microRNA是由內(nèi)含子或編碼基因間隔區(qū)的RNA基因編碼的,長度大小為18-24個堿基的小分子RNA,能通過與靶m RNA特異性的堿基配對引起靶m RNA的降解或抑制其翻譯,從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控。但對于賈第蟲病毒是否存在microRNA尚不清楚。本研究通過Solexa高通量測序及生物信息學分析結(jié)合VMIR軟件預測,初步確定5條賈第蟲病毒候選非編碼小RNA,利用RT-PCR、Northern雜交、Dicer酶切割、熒光定量PCR等方法驗證賈第蟲病毒一條小RNA為賈第蟲病毒的microRNA,命名為GLV microRNA1,其大小為22nt,尤為重要的是其位于pol蛋白編碼區(qū),這也是目前所發(fā)現(xiàn)的第一條原蟲病毒的microRNA。熒光原位雜交試驗顯示賈第蟲病毒GLV microRNA1確實存在,且定位在細胞質(zhì)中,符合經(jīng)典的microRNA定位。賈第蟲病毒microRNA功能研究通過knock-down GLV MicroRNA1,熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)抑制GLV microRNA1后,賈第蟲病毒拷貝數(shù)增長30%左右,表明GLV microRNA1能有效控制賈第蟲病毒的拷貝數(shù)。流式細胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡也顯示,轉(zhuǎn)染GLV microRNA1組賈第蟲滋養(yǎng)體的數(shù)量及亮度均明顯下降,而轉(zhuǎn)染反義GLV microRNA1組賈第蟲滋養(yǎng)體的數(shù)量及亮度均明顯上升。但GLV microRNA1對賈第蟲形態(tài)和生長曲線等尚未發(fā)現(xiàn)有明顯的影響。雙熒光素酶報告試驗測定表明GLV microRNA1的靶標gag-pol的3'UTR發(fā)揮重要作用,同時其作用方式為切割靶序列。GLV microRNA1是目前發(fā)現(xiàn)的第一條位于基因的編碼區(qū)域的microRNA。該發(fā)現(xiàn)可能進一步拓寬了人們對非編碼RNA的生成方式認知,即m RNA可能需要在編碼小RNA和翻譯蛋白質(zhì)之間有一個平衡,這種平衡可能是基因表達調(diào)控的一種新方式。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7

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本文編號：1273299