本文關(guān)鍵詞：棉花異質(zhì)型ACCase基因家族鑒定與功能分析

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【摘要】：棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物。棉籽中含有豐富的脂肪酸,可用于加工食用油、工業(yè)原料和生物柴油。異質(zhì)型ACCase(heterromeric Acetyl-CoA carboxylase,ACCase)是各種脂肪酸從頭合成的限速酶和關(guān)鍵酶,它由生物素羧化酶(BC)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)及羧基轉(zhuǎn)移酶(CT)的2個(gè)亞基α-CT和β-CT組成。本研究是在棉屬(Gossypium)二倍體種(雷蒙德氏棉、亞洲棉)和四倍體種(陸地棉、海島棉)基因組測(cè)序完成的基礎(chǔ)上,對(duì)棉花異質(zhì)型ACCase的三個(gè)核基因組編碼的亞基基因家族進(jìn)行全基因組水平鑒定和比較;在低溫和鹽脅迫處理下,雷蒙德氏棉、亞洲棉(石系亞1號(hào))和陸地棉(TM-1)中所CCP基因響應(yīng)的方式存在差異;結(jié)合公共數(shù)據(jù)中陸地棉(G.hirsutum)TM-1脅迫條件下的RNA-Seq數(shù)據(jù),探究BCCP、BC和CTα基因家族成員在不同非生物脅迫下的應(yīng)答反應(yīng)。對(duì)GhBCCP1蛋白亞細(xì)胞預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,并克隆其上游1.5kb的啟動(dòng)子序列,進(jìn)行缺失系列載體構(gòu)建和活性研究。對(duì)Xu244(轉(zhuǎn)基因受體材料)中異質(zhì)型ACCase四亞基基因在各組織和不同非生物脅迫中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。對(duì)異質(zhì)型GhACCase四亞基中過(guò)表達(dá)單基因轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行篩選、油分測(cè)定,兩兩聚合。取得的主要研究結(jié)果如下:1.從雷蒙德氏棉、亞洲棉、陸地棉和海島棉全基因組數(shù)據(jù)中分別鑒定出24個(gè)BCCP基因(4個(gè)GaBCCP、4個(gè) GrBCCP、8 個(gè) GhBCCP和 8 個(gè) GbBCCP)、12 個(gè) BC基因(2 個(gè) GaBC、2 個(gè) GBBC、4 個(gè) GhBC 和 4 個(gè) GbBC)和 11 個(gè) CTα基因(3 個(gè) GaCTα、2 個(gè) GrCTα、4 個(gè)GhCTα和2個(gè)GbCTα),均以單個(gè)基因的形式分布在染色體上。亞洲棉中CTα基因比雷蒙德氏棉中多1個(gè),陸地棉CTα基因比海島棉中多2個(gè)。對(duì)四個(gè)棉種中BCCP基因成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果表明BCCP基因家族可分為2個(gè)組;組Ⅰ中基因長(zhǎng)度比組Ⅱ中的變化大,兩個(gè)組的基因結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜;基因復(fù)制結(jié)果表明,片段復(fù)制是導(dǎo)致陸地棉和海島棉中BCCP基因數(shù)目擴(kuò)增的主要原因。四個(gè)棉種間分別成功鑒定出20組、6組和6組BCCP、BC和CTα直系同源基因,其中分別有11組、3組和3組BCCP、BC和CTα直系同源基因結(jié)構(gòu)非常相似,剩余9組BCCP、3組BC和3組CTα直系同源基因結(jié)構(gòu)存在差異,推測(cè)大多數(shù)直系同源基因的基因結(jié)構(gòu)保守性一般。2.雷蒙德氏棉、亞洲棉(石系亞1號(hào))和陸地棉(TM-1)中16個(gè)BCCP基因在鹽脅迫24h后,6個(gè)BCCP基因在根中表達(dá)上調(diào),在莖中,雷蒙德氏棉和亞洲棉中的BCCP基因鹽脅迫24h后表達(dá)上調(diào);低溫脅迫下,GrBCCP3、GaBCCP1、GaBCCP2、GaBCCP3、GaBCCP4 和 GhBCCP7在根中誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。GrBCCP3、GaBCCP1、GaBCCP3和GaBCCP4低溫脅迫24h后,在莖中上調(diào)表達(dá);同時(shí)發(fā)現(xiàn)在鹽和低溫脅迫24h后,GrBCCP3、GaBCCP1、GaBCCP2和GaBCCP4在莖中均表達(dá)上調(diào),GaBCCP1和GaBCCP3在葉片中均誘導(dǎo)表達(dá)。基于TM-1不同組織和不同非生物脅迫的RNA-Seq數(shù)據(jù),對(duì)陸地棉中8個(gè)BCCP、4個(gè)BC和4個(gè)CTα基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本分析,結(jié)果表明它們?cè)跈z測(cè)的組織中均有表達(dá),其中4個(gè)BCCP基因(GhBCCP2、GhBCCP4、GhBCCP6和 GhBCCP7)、2 個(gè)BC基因(GhBC和 GhB3)和 2 個(gè) CTα 基因(GhCTα1 和 GhCTα3)在不同發(fā)育時(shí)期的幼胚中轉(zhuǎn)錄水平較高,這些基因可能對(duì)脂肪酸積累起到積極作用;在不同非生物脅迫下,GhBCCP1在鹽脅迫、干旱脅迫處理下呈現(xiàn)升-降-升趨勢(shì),表明GhBCCP1基因在這兩種脅迫中可能受到反饋調(diào)節(jié)作用;在鹽脅迫、干旱和熱脅迫處理下,GhBCCP5和GhBCCP6下調(diào)表達(dá),可能起負(fù)調(diào)控作用;熱脅迫處理下陸地棉中4個(gè)GhBC上調(diào)表達(dá),說(shuō)明這4個(gè)GhBC基因在熱脅迫下起正向調(diào)控作用;熱脅迫、干旱和鹽脅迫處理12h后,陸地棉中GhCTα1、GhCTα3和GhCTα4基因上調(diào)表達(dá),可能這三個(gè)基因在這三種脅迫下起正向調(diào)控作用。這些結(jié)果表明GhBCCP、GhBC和GhCTα基因成員確實(shí)參與不同非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。3.GhBCCP1蛋白定位在葉綠體上,GhBCCP1啟動(dòng)子系列缺失片段研究發(fā)現(xiàn),在1449-1195 bp之間存在比較重要的DOF核心元件和1個(gè)MYB元件,它們對(duì)啟動(dòng)子活性有很大的影響。4.異質(zhì)型GhACCαse四個(gè)亞基基因在Xu244材料的根、莖、葉和纖維不同發(fā)育時(shí)期的組織中均有表達(dá),但表達(dá)水平不同,其中GhCTβ在葉片中的表達(dá)量最高,推測(cè)可能是葉片中葉綠體含量比較豐富。在ABA處理12h后,GhBCCP1、GhBC1、GhCTα2和GhCTβ均上調(diào)表達(dá),推測(cè)在ABA處理12 h后這四個(gè)基因可能協(xié)同響應(yīng)ABA處理,而在低溫和MeJA處理下表達(dá)模式并不一致,暗示異質(zhì)型ACCase四個(gè)亞基在低溫和MeJA處理下有不同的應(yīng)答機(jī)制。5.八份材料的棉仁油分含量測(cè)定結(jié)果表明,棉仁在20-30 DPA階段油分積累速度最快,30-35 DPA階段油分積累速度變慢,35-40 DPA階段有4份材料棉仁油分含量開(kāi)始下降;8份棉花材料幼胚的不同發(fā)育時(shí)期,異質(zhì)型GhACCase四個(gè)亞基基因表達(dá)結(jié)果顯示,棉仁油分含量較高的材料,四個(gè)基因表達(dá)高峰集中在幼胚發(fā)育的同一時(shí)期,如10H1041的油分含量為35.29%,四個(gè)亞基表達(dá)高峰均在幼胚發(fā)育的25 DPA;棉仁油分含量相對(duì)高的材料,三個(gè)基因表達(dá)高峰出現(xiàn)在幼胚發(fā)育的同一時(shí)期,如11-0514和10H1007的油分含量分別為29.51%和29.69%,GhBCCP1、GhBC1和GhCTα2表達(dá)高峰均在幼胚發(fā)育的35 DPA,10H1014材料的油分含量為33.55%,GhBCCP1、GhBC1和GhCTα2表達(dá)高峰在幼胚發(fā)育的25DPA;棉籽油分含量低的材料,兩個(gè)基因表達(dá)高峰在同一個(gè)時(shí)期(GhBCCP1和GhhC1、GhCTα2和GhCTβ表達(dá)高峰分別在幼胚發(fā)育的不同時(shí)期)或四個(gè)亞基表達(dá)高峰均不在一個(gè)時(shí)期,如Xu244、11-0711、11-0509和11-0512。這些結(jié)果表明棉籽油分含量高的棉花材料,異質(zhì)型ACCase四個(gè)亞基基因在種子油分積累的主要時(shí)期傾向于協(xié)同表達(dá),而在棉籽油分含量低的材料中,其在油分積累的主要時(shí)期協(xié)同表達(dá)趨勢(shì)較弱。6.過(guò)表達(dá)異質(zhì)型GhACCase的單個(gè)亞基材料中,T3代GhBCCP1轉(zhuǎn)基因株系油分含量增加21.92%,達(dá)到顯著水平;GhBC1轉(zhuǎn)基因株系和GhCTβ轉(zhuǎn)基因株系的油分含量均約增加17%,達(dá)到顯著水平;GhCTα2轉(zhuǎn)基因株系的油分含量較受體材料未達(dá)顯著水平。說(shuō)明過(guò)表達(dá)GhBCCP1、GhBC1和GhCTβ基因均能提高棉籽油分,而GhCTα2基因提高油分的功能有待進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)GhCTβ基因的T5代棉仁平均含油量較對(duì)照提高4.27百分點(diǎn),過(guò)表達(dá)GhBCCP1和GhBC1的T5代轉(zhuǎn)基因材料棉仁平均油分含量較對(duì)照分別提高1.01和1.67個(gè)百分點(diǎn),GhCTα2的T5代轉(zhuǎn)基因材料比對(duì)照平均降低0.51個(gè)百分點(diǎn),本研究中T6和T9代四個(gè)亞基轉(zhuǎn)基因材料油分結(jié)果與T5代的結(jié)果基本一致。這些結(jié)果表明分別過(guò)表達(dá)GhCTβ、GhBC1和GhBCCP1單亞基對(duì)提高棉仁油分具有一定的潛能。GhBCCP1×GhCTβ的兩個(gè)聚合株系成熟期棉仁油分含量與親本無(wú)顯著區(qū)別,而GhCTβ×GhBC1和GhBCCP1×GhCTα2聚合材料成熟期的棉仁油分含量顯著低于親本材料。這些結(jié)果表明目前兩兩聚合的亞基轉(zhuǎn)基因材料沒(méi)有顯著提高油分含量,其原因可能是兩聚合的轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)沒(méi)有提高ACCase的活性,將四個(gè)亞基全部聚合在一起進(jìn)行過(guò)表達(dá)或許可以提高棉籽油分含量,但這推論還需進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S562

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1273009