本文關(guān)鍵詞：Viperin蛋白抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制及其分子機(jī)制

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)屬于套式病毒目,動(dòng)脈炎病毒科,動(dòng)脈炎病毒屬的有囊膜單股正鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)15kb左右,具有nsp1-nsp12 14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和9個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,能造成母豬懷孕后期流產(chǎn),產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎等,引起仔豬、育肥豬呼吸道癥狀,死亡率升高。該病毒強(qiáng)烈抑制干擾素的產(chǎn)生,但外源IFNs對(duì)該病毒的復(fù)制具有強(qiáng)烈的抑制作用。Viperin屬于干擾素刺激基因,對(duì)多種病毒均具有抗病毒作用。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增并克隆了豬和猴的Viperin基因,制備了該蛋白的多克隆抗體,首次證明了猴的Viperin蛋白具有抑制PRSV復(fù)制的作用,并揭示了其抗病毒機(jī)理。構(gòu)建了豬的Viperin蛋白腺病毒表達(dá)載體,并在Marc-145細(xì)胞和PAMSs細(xì)胞上驗(yàn)證了豬Viperin蛋白對(duì)PRRSV的抗病毒作用,具體實(shí)驗(yàn)如下:1.豬、猴Viperin基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)與抗體制備Viperin基因作為干擾素下游基因(ISG),本實(shí)驗(yàn)為研究其抗病毒活性,從Marc-145和PK-15細(xì)胞提取并克隆了該基因。將Marc-145細(xì)胞和PK細(xì)胞鋪24板,用IFN-α刺激24h后收集細(xì)胞,提取RNA,分別采用RT-PCR方法擴(kuò)增猴和豬的Viperin基因,并克隆進(jìn)入pEASY-blunt simple平末端連接測(cè)序載體,酶切鑒定后送公司測(cè)序。采用DNAstar分析豬和猴Viperin蛋白的免疫原性和疏水性,選取抗原性較好的一段基因,采用PCR擴(kuò)增后,插入pET-28a+大腸桿菌表達(dá)載體,在37℃條件下IPTG誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21, SDS-PAGE分析證明Viperin重組蛋白以包涵體的形式表達(dá),包涵體蛋白經(jīng)過(guò)純化后得到目的蛋白,將純化蛋白與弗式完全佐劑進(jìn)行乳化后頸背部皮下注射BALB/c小鼠,兩周后加強(qiáng)免疫一次,收集小鼠血清。采用Western-blot、IFA實(shí)驗(yàn)確定制備多克隆抗體的特異性,該多克隆抗體可以分別與腺病毒表達(dá)和真核表達(dá)載體pCI-sVIP等表達(dá)的Viperin蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng),為下一步研究豬和猴Viperin蛋白抗病毒性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。2.猴Viperin抑制PRRSV復(fù)制及其分子機(jī)制宿主抵抗病毒感染的第一道防線是先天性免疫反應(yīng)。先天性免疫反應(yīng)以干擾素的產(chǎn)生為特征,干擾素可刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列抗病毒蛋白。Viperin是干擾素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白,對(duì)多種病毒的復(fù)制有抑制作用,但抗病毒機(jī)制仍然不明確。本文研究了mViperin蛋白在Marc-145細(xì)胞內(nèi)對(duì)PRRSV復(fù)制的作用,結(jié)果表明,IFN-α接種Marc-145細(xì)胞后可誘導(dǎo)mViperin基因的上調(diào),并可以以劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)的方式抑制PRRSV復(fù)制。PRRSV感染細(xì)胞后,IFN-α基因的上調(diào)受到明顯抑制,PRRSV通過(guò)干擾素非依賴(lài)途徑誘導(dǎo)mViperin基因的表達(dá)。用過(guò)表達(dá)mViperin蛋白可通過(guò)劑量依賴(lài)的方式抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,采用干擾siRNA方法缺失細(xì)胞內(nèi)Viperin蛋白基因,PRRSV復(fù)制水平有所增加。此外,本研究發(fā)現(xiàn)mViperin蛋白抑制了 PRRSV的入胞,阻礙了 PRRSV基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯,但其對(duì)病毒的裝配和出殼沒(méi)有作用。利用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證明mViperin蛋白和PRRSV的GP5、N蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象。進(jìn)一步用CO-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,mViperin蛋白和PRRSV N蛋白在細(xì)胞內(nèi)可相互作用,并發(fā)現(xiàn)mViperin蛋白N端第12-16位氨基酸對(duì)mViperin的抗病毒活性有重要的影響,mViperin α-helix區(qū)域影響該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和形態(tài)分布。3.豬Viperin重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定Viperin作為干擾素刺激基因,在多種體細(xì)胞均有表達(dá),且對(duì)多種種屬的病毒具有抗病毒活性。為了深入研究豬的Viperin蛋白在Marc-145和PAMS細(xì)胞上的抗病毒活性,本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增豬Viperin基因,克隆進(jìn)入穿梭載體pTrack-CMV-sViperin,經(jīng)菌液PCR,酶切鑒定后送公司測(cè)序正確。利用Pme-I內(nèi)切酶線性化穿梭載體,電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183后與腺病毒骨架載體pAdEasy-1進(jìn)行同源重組,提取重組后的腺病毒基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶Pac-I線性化后轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞,裝配成完整的病毒粒子rAd-Viperin。在顯微鏡下觀察重組腺病毒rAd-Viperin感染細(xì)胞,可見(jiàn)GFP的表達(dá)。通過(guò)RT-PCR、Western-blot檢測(cè)sViperin蛋白的表達(dá),重組腺病毒可正確表達(dá)豬Viperin蛋白,且具有良好的豬Viperin反應(yīng)原性,為下一步研究堵Viperin蛋白對(duì)PRRSV的抗病毒活性奠定基礎(chǔ)。4.豬Viperin蛋白抑制PRRSV復(fù)制作用研究本研究構(gòu)建了 pCI-sVIP表達(dá)載體,并利用pCI-sVIP研究了 sViperin蛋白在Marc-145細(xì)胞上對(duì)PRRSV復(fù)制的作用,結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)sViperin蛋白可以抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的復(fù)制,且具有劑量依賴(lài)作用。實(shí)驗(yàn)證明sViperin蛋白抑制病毒的入胞,但其對(duì)病毒的裝配和釋放沒(méi)有影響作用。另外,共聚焦實(shí)驗(yàn)證明sViperin蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器。sViperin蛋白和病毒的GP5、N蛋白在Marc-145細(xì)胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象,進(jìn)一步利用CO-IP實(shí)驗(yàn)證明,sViperin蛋白可以和N蛋白進(jìn)行共沉淀,證明sVierin蛋白可以和N蛋白相互作用。進(jìn)一步采用表達(dá)重組sViperin蛋白的腺病毒rAd-sVIP接種PAMSs細(xì)胞,結(jié)果證明過(guò)表達(dá)sViperin在PAMSs細(xì)胞以劑量依賴(lài)的方式抑制PRRSV的復(fù)制,且腺病毒表達(dá)的sViperin同樣可抑制PRRSV的入胞。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
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本文編號(hào)：1272728