發(fā)布時間：2017-12-09 17:26

  本文關鍵詞：PA基因影響流感病毒哺乳動物適應性和致病性的機制

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【摘要】：動物流感病毒不僅持續(xù)危害畜牧業(yè),給畜牧業(yè)造成嚴重經濟損失,而且可以跨越種間障礙感染人群,給公共衛(wèi)生安全構成嚴重威脅。因此,解析影響流感病毒在哺乳動物適應性和致病性的分子機制,對流感的防控具有重要意義。PA基因是A型流感病毒基因組的八個基因節(jié)段之一,研究表明,PA基因所編碼的病毒蛋白與流感病毒的宿主特異性和適應性密切相關,但PA蛋白哪些氨基酸位點的突變而導致病毒的適應性以及致病性的改變尚未完全解析。本研究通過對NCBI數據庫中H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、新型基因重組H7N9和H10N8病毒的PA蛋白序列進行系統(tǒng)比對分析發(fā)現(xiàn),隨著時間的推移,H9N2禽流感病毒的PA-356R逐漸取代PA-356K成為絕對優(yōu)勢流行。而且,2013年在我國首次爆發(fā)感染人的新型重組H7N9和H1ON8病毒也都主要表現(xiàn)為PA-356R,而該新型重組H7N9和H10N8病毒的PA基因恰來源于H9N2AIV。PB2-627K已被廣泛證明與AIV適應哺乳動物密切相關,我們發(fā)現(xiàn),與禽源H7N9和H10N8病毒相比,感染人群的H7N9和H10N8病毒普遍出現(xiàn)PA-356R和PB2-627K共存在的現(xiàn)象。因此,我們推測AIV可能通過PA-356R單獨或協(xié)同PB2-627K發(fā)揮作用,增強病毒對哺乳動物的適應性和致病性,最終促進了新型重組H7N9和H10N8病毒在人群的爆發(fā)。為驗證PA-K356R突變增強AIV在哺乳動物的適應性和致病性這一推測,我們以一株H9N2病毒(A/chicken/Hebei/LC/2008)作為骨架,利用定點突變技術和反向遺傳操作技術構建了PA-K356R單突變、PB2-E627K單突變以及PA-K356R和PB2-E627K雙突變的三株重組病毒,并評價這些重組病毒在哺乳動物體內和體外的生物學特性。結果顯示,PA-K356R突變顯著增強H9N2病毒PA蛋白在哺乳動物細胞系上的核輸入效率,聚合酶活性及基因組轉錄與復制能力研究結果表明,PA-K356R或PB2-E627K單突變可顯著增強H9N2病毒的在哺乳動物細胞系上的聚合酶活性,以及病毒mRNA與vRNA的轉錄復制能力,而且PA-K356R和PB2-E627K同時存在時表現(xiàn)出協(xié)同增強的效果。在體外培養(yǎng)哺乳動物細胞系和小鼠體內感染性研究結果表明,PA-K356R或PB2-E627K單突變可以增強病毒體外和體內的復制力,以及增強病毒在小鼠的致病性,并誘導了在小鼠高水平的促炎／炎性細胞因子表達,且PA-K356R和PB2-E627K雙突變表現(xiàn)出協(xié)同效應。因此,PA-K356R突變增強AIV在哺乳動物的適應性和致病性。最近研究發(fā)現(xiàn),PA基因不僅編碼PA蛋白,而且還編碼PA-X蛋白。PA-X蛋白對豬流感病毒生物學特性的影響尚不清楚。為解析PA-X蛋白對豬源流感病毒生物學特性的影響,我們以H1N2豬流感病毒(SIV, A/swine/Guangdong/1222/2006)為骨架,利用定點突變技術和反向遺傳操作技術構建了PA-X蛋白缺失的重組H1N2SIV,并評價這些重組病毒在體外培養(yǎng)豬源細胞和豬體內的生物學特性。體外研究結果顯示,PA-X蛋白缺失后的重組H1N2 SIV在體外培養(yǎng)豬源細胞系和豬呼吸系統(tǒng)組織上的生長復制能力都顯著減弱。體內研究結果表明,PA-X蛋白缺失后,H1N2SIV在豬體內的復制力和致病性也顯著降低,且在豬群之間的傳播性顯著減弱。進一步的研究表明,豬流感病毒可通過PA-X的“宿主關閉”功能抑制宿主細胞的先天性免疫應答,降低了宿主的抗病毒能力,從而有利于病毒在感染宿主的生長復制。序列分析表明,PA-X蛋白的X-ORF存在兩種長度：全長形式的61個氨基酸和截短形式的41個氨基酸。進一步對NCBI數據庫中所有SIV的PA-X蛋白進行序列比對分析發(fā)現(xiàn),自從1930年首次在豬群中分離到SIV至1985年,所有SIV的PA-X的X-ORF均表現(xiàn)為全長形式,隨后出現(xiàn)X-ORF為截短形式的PA-X,而且隨著時間推移,編碼截短形式PA-X的SIV逐漸取代編碼全長形式PA-X的SIV,并在豬群中趨于優(yōu)勢流行,截止到2014年,95%的SIV編碼截短形式的PA-X蛋白。因此我們提出假設：截短形式的PA-X可能有助于增強SIV在豬群中的適應性?為驗證截短形式的PA-X蛋白可能有助于增強SIV在豬群中的適應性這一假設,我們以一株編碼截短形式PA-X的H1N2 SIV (A/swine/Guangdong/1222/2006)為骨架,構建了一株編碼全長形式PA-X的重組病毒,并評價PA-X蛋白長度對這兩株SIV體外和體內生物學特性的影響。研究結果顯示,截短PA-X的SIV在體外培養(yǎng)豬源細胞系和豬呼吸系統(tǒng)組織上的復制能力顯著強于編碼全長形式PA-X的SIV。攻毒實驗結果表明,截短形式PA-X有助于增強SIV在豬的復制力、致病性和傳播性。進一步的研究表明,無論在感染豬體內還是體外細胞系,與全長形式的PA-X蛋白相比,截短的PA-X都擁有更強的抑制IFN表達的能力,從而降低宿主的抗病毒能力。綜上所述,本研究揭示了PA-K356R可以增強AIV在哺乳動物的適應性和致病性,并初步解析了其增強AIV在哺乳動物適應性和致病性的分子機制。證明了PA-X蛋白具有抑制免疫應答的功能,從而有利于增強H1N2 SIV在豬中的適應性和致病性。而且,與全長PA-X相比,截短PA-X可進一步促進SIV在豬群中的適應性和致病性。本研究為動物源流感病毒在哺乳動物流行潛力評估和防控提供了理論依據。
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
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本文編號：1271245