本文關(guān)鍵詞：泛素特異性蛋白酶USP15調(diào)控Ⅰ型干擾素的機(jī)制研究以及PRRSV感染細(xì)胞的泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)

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【摘要】：泛素化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,是指單個(gè)或多個(gè)泛素分子連接到目標(biāo)蛋白賴氨酸(Lys)殘基上的修飾過(guò)程,需要E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶以及E3泛素連接酶的共同參與。在細(xì)胞生命過(guò)程中起著重要調(diào)控作用,涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、蛋白相互作用以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面。干擾素(IFN)是宿主抗病毒感染的重要防御機(jī)制,也是當(dāng)前抗病毒天然免疫研究的重點(diǎn)。I型干擾素表達(dá)異常會(huì)引發(fā)相關(guān)的免疫疾病,因此嚴(yán)格調(diào)控I型干擾素對(duì)于維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)十分重要。泛素化作為一種熱門并且關(guān)鍵的翻譯后修飾,在干擾素產(chǎn)生及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著關(guān)鍵角色。泛素特異性蛋白酶(USPs)是家族成員數(shù)目最多的去泛素化酶(DUBs),正受到廣泛的關(guān)注,其功能和結(jié)構(gòu)因家族成員眾多而存在多樣性。本實(shí)驗(yàn)以USP15作為研究對(duì)象,深入探究其在調(diào)節(jié)I型干擾素信號(hào)通路中的作用,為擴(kuò)充USPs家族的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。泛素化修飾不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多項(xiàng)生理功能,還參與調(diào)控多種病毒的復(fù)制與增殖過(guò)程,如牛病毒性腹瀉病毒基因組有泛素和類泛素基因;輪狀病毒等利用泛素蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)自身復(fù)制;人免疫缺陷病毒等編碼蛋白可以發(fā)生泛素化修飾;流感病毒等通過(guò)編碼具有E3泛素連接酶活性的蛋白或者其他途徑調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白的泛素化修飾。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是危害當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的重要病原,其免疫機(jī)制十分復(fù)雜。目前關(guān)于泛素化修飾在PRRSV感染與免疫中的作用尚不清楚。因此本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)前后泛素化修飾進(jìn)行了定量分析,揭示泛素化修飾在PRRSV感染與致病性方面發(fā)揮的重要作用。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.泛素特異性蛋白酶USP15調(diào)控I型干擾素的機(jī)制研究在我們前期通過(guò)siRNA篩選調(diào)控干擾素的泛素特異性蛋白酶時(shí),發(fā)現(xiàn)干擾USP15后可以上調(diào)ISRE啟動(dòng)子活性,因此對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。干擾分子干擾內(nèi)源性USP15基因后仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)(啟動(dòng)子水平,mRNA水平以及蛋白水平)、IRF3和NF-κB啟動(dòng)子活性及磷酸化修飾、ISRE啟動(dòng)子活性及干擾素刺激基因(ISGs)的表達(dá)都有明顯上調(diào),而在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)USP15后則呈現(xiàn)顯著的抑制效果。此外,我們還通過(guò)觀察對(duì)干擾素高度敏感的水泡性口膜炎病毒(VSV-GFP)的增殖情況,證實(shí)超表達(dá)USP15可以顯著抑制干擾素的產(chǎn)生。進(jìn)一步的體外及體內(nèi)去泛素實(shí)驗(yàn)證實(shí)USP15具有去泛素活性且活性位點(diǎn)是第269位C(半胱氨酸)及862位H(組氨酸)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),USP15可以特異性去除RIG-I K63形式偶聯(lián)的多聚泛素。通過(guò)分析USP15的突變體,發(fā)現(xiàn)USP15 DUB活性位點(diǎn)突變后其抑制IFN-β活性的能力顯著降低但并未完全喪失,表明USP15抑制干擾素產(chǎn)生需要但不完全依賴其DUB活性。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)USP15可以與RIG-I直接相互作用,并且競(jìng)爭(zhēng)性抑制RIG-I對(duì)IPS-1的募集,而且DUB活性位點(diǎn)突變的USP15突變體同樣可以通過(guò)與RIG-I發(fā)生相互作用進(jìn)而減弱RIG-I與IPS-1之間的結(jié)合,進(jìn)一步證實(shí)USP15可以通過(guò)不依賴去泛素化活性的方式抑制干擾素產(chǎn)生。因此,USP15可以通過(guò)兩種不同的機(jī)制抑制干擾素產(chǎn)生及其信號(hào)通路:(1)USP15特異性去除RIG-I K63形式連接的多聚泛素;(2)USP15競(jìng)爭(zhēng)性抑制RIG-I對(duì)IPS-1的募集作用。2.PRRSV感染細(xì)胞的泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)將PRRSV WUH3株感染豬原代肺泡巨噬細(xì)胞,于感染后36 h收集被感染細(xì)胞,利用Label-free技術(shù),結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS),對(duì)PRRSV感染細(xì)胞泛素化修飾的變化情況進(jìn)行檢測(cè)和分析。共鑒定出315個(gè)蛋白的431個(gè)泛素化位點(diǎn)修飾顯著上調(diào),402個(gè)蛋白的552個(gè)泛素化位點(diǎn)修飾顯著下調(diào)。通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)修飾存在顯著差異蛋白的亞細(xì)胞定位、生物學(xué)功能、KEGG代謝通路等進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)修飾顯著差異蛋白與蛋白酶體降解、蛋白定位以及能量代謝等多種生物進(jìn)程相關(guān),并且發(fā)生泛素化修飾的motif有3種,分別為:Kub XXP、RXXXXLXKub和KubQ。將PRRSV WUH3株感染PAM細(xì)胞后的差異蛋白質(zhì)組學(xué)與泛素化修飾組學(xué)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,證實(shí)泛素化修飾與蛋白表達(dá)量之間沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)。通過(guò)對(duì)修飾存在顯著差異蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行深入分析,發(fā)現(xiàn)許多蛋白與干擾素信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路相關(guān),如TRAF6、IL-1β、HMGB1、JAK1、Mx2以及ISG15等,表明泛素化修飾的改變?cè)赑RRSV調(diào)控干擾素及炎癥反應(yīng)中起到了關(guān)鍵作用。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)PRRSV編碼的15種蛋白(nsp1β、nsp2、nsp3、nsp4、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11、nsp12、ORF2a、ORF3、ORF5、ORF6、ORF7)的64個(gè)位點(diǎn)存在泛素化修飾,包括參與RNA合成、誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生以及決定病毒感染力的非結(jié)構(gòu)蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白,而且我們還發(fā)現(xiàn)泛素蛋白酶體途徑抑制劑處理PAM細(xì)胞后PRRSV的增殖受到明顯抑制,提示泛素化修飾可能在PRRSV的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及蛋白合成中發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1269213