本文關鍵詞：衛(wèi)星RNA促進甜菜黑色焦枯病毒侵染本生煙的轉錄譜分析

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【摘要】：甜菜黑色焦枯病毒(beet black scorch virus,BBSV)能夠系統(tǒng)侵染本生煙,當與其衛(wèi)星RNA共同侵染時,BBSV系統(tǒng)侵染本生煙能力增強,尤其在較低溫度(18℃)下導致的病毒侵染癥狀明顯加重。衛(wèi)星RNA促進BBSV侵染本生煙的作用機制尚無報道。本論文利用芯片雜交和RNA測序兩種高通量研究方法,對BBSV及其衛(wèi)星RNA侵染后的本生煙進行轉錄譜分析,希望借以研究衛(wèi)星RNA促進病毒侵染、加重植株發(fā)病癥狀的機制,為深入了解病毒侵染寄主植物后的致病過程和致病機理提供基礎。本文利用芯片雜交和RNA測序兩種方法對BBSV及其衛(wèi)星RNA接種后侵染早期的本生煙葉片進行了轉錄譜分析。其中,在基因芯片實驗中,以未接種病毒的健康植物為對照,比較了 BBSV侵染、或BBSV與衛(wèi)星RNA共同侵染本生煙,以及在侵染后不同時間寄主植物基因的表達情況,共獲得4503個差異表達的基因。這些被激活的基因除了分布在與生物合成有關的核糖體(Ribosome)、蛋白酶體(Proteasome)、光合作用(Photosynthesis)等重要通路中,尤其值得關注的是一些與植物激素合成(Biosynthesis of plant hormones)或植物-病毒相互作用(Plant-pathogen interaction)等通路相關的基因表達量迅速上調,而衛(wèi)星RNA的加入則使得這種上調變化減弱。為了彌補基因芯片無法檢測未知基因的局限和不足,進一步采用了高通量RNA測序技術對差異表達基因進行檢測,以挖掘更多的可能參與抵抗BBSV侵染過程的植物基因。RNA測序分析結果與芯片雜交結果一致,即病毒侵染后植物體內各種抗性基因及通路響應顯著,衛(wèi)星RNA的加入對本生煙內因BBSV侵染而產(chǎn)生的基因差異表達具有抑制作用。進一步將BBSV與衛(wèi)星RNA共同侵染的樣品與BBSV單獨侵染的本生煙樣品進行比較分析,結果表明衛(wèi)星RNA加重侵染癥狀可能與基因沉默(3個差異表達基因)、植物抗性基因(35個差異表達基因)、轉錄因子(47個差異表達基因)、受體蛋白(49個差異表達基因)、泛素化(34個差異表達基因)、生長素(17個差異表達基因)等相關途徑基因表達變化相關,BBSV侵染引起這些基因的差異表達因衛(wèi)星RNA加入而受到抑制,從而減弱了本生煙對BBSV侵染的抗病響應。為了深入了解衛(wèi)星RNA在以上過程中的作用,對植物基因沉默通路相關基因又進行了分析驗證。結果表明,BBSV侵染本生煙后,基因沉默通路中關鍵功能基因RDR6(RNA-directed RNA polymerase 6)、DCL2(Dicer-like protein 2)、AGO1(argonaute protein 1)、AGO2(argonaute protein 2)表達量上調,推斷本生煙可能是通過上調這些基因的表達量以提高基因沉默效率從而增強植物抗病毒能力。與BBSV單獨侵染相比,衛(wèi)星RNA的加入抑制了AGO2表達量的上調,由此推測衛(wèi)星RNA可能通過降低沉默通路關鍵基因的表達水平來降低植物抗性。另外,與未接種的健康植物相比,在AGO2表達量上調的同時,檢測到miR403表達量下調,鑒于AGO2是miR403的靶標蛋白,miR403可以介導AGO1對AG02的降解,所以推測BBSV的侵染可能通過抑制miR403的表達來上調AGO2的表達量。然而,與BBSV單獨侵染相比,衛(wèi)星RNA的加入使AGO2的積累量下降,但miR403積累量也同時表現(xiàn)為更大程度的下降,說明衛(wèi)星RNA加入后植物對AGO2的調控還存在其他途徑。為了獲得較高可信度的轉錄譜分析結果,本論文還進行了適用于病毒侵染本生煙實時熒光定量PCR(qPCR)分析的內參基因篩選工作。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)中BBSV侵染后本生煙內穩(wěn)定表達的基因和文獻報道中常用的內參基因信息,選取了 26個候選基因,通過qPCR檢測發(fā)病葉片中候選內參基因的表達量,經(jīng)過geNorm、NormFinder和BestKeeper三個軟件分析,最終確定NbUP7和GBP為煙草壞死病毒A(TNV-A)、甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)、甜菜壞死黃脈病毒(BNYVV)、大麥條紋花葉病毒(BSMV)和馬鈴薯X病毒(PVX)五種病毒侵染本生煙后相對表達最穩(wěn)定的內參基因,可以用于qPCR分析。綜上所述,衛(wèi)星RNA可能通過抑制本生煙內相關通路因BBSV侵染而產(chǎn)生的基因差異表達,從而減弱本生煙對病毒的抗病響應,降低本生煙防御BBSV的能力,導致病毒侵染本生煙的發(fā)病癥狀加重。
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S435.663

【參考文獻】

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1 席德慧;曹云鶴;郭立華;原雪峰;蔡祝南;韓成貴;李大偉;于嘉林;;甜菜黑色焦枯病毒新疆分離物基因組RNA的序列分析及侵染性cDNA克隆構建[J];病毒學報;2006年04期

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本文編號：1261678