本文關(guān)鍵詞：衛(wèi)星RNA促進(jìn)甜菜黑色焦枯病毒侵染本生煙的轉(zhuǎn)錄譜分析

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【摘要】：甜菜黑色焦枯病毒(beet black scorch virus,BBSV)能夠系統(tǒng)侵染本生煙,當(dāng)與其衛(wèi)星RNA共同侵染時(shí),BBSV系統(tǒng)侵染本生煙能力增強(qiáng),尤其在較低溫度(18℃)下導(dǎo)致的病毒侵染癥狀明顯加重。衛(wèi)星RNA促進(jìn)BBSV侵染本生煙的作用機(jī)制尚無報(bào)道。本論文利用芯片雜交和RNA測序兩種高通量研究方法,對BBSV及其衛(wèi)星RNA侵染后的本生煙進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜分析,希望借以研究衛(wèi)星RNA促進(jìn)病毒侵染、加重植株發(fā)病癥狀的機(jī)制,為深入了解病毒侵染寄主植物后的致病過程和致病機(jī)理提供基礎(chǔ)。本文利用芯片雜交和RNA測序兩種方法對BBSV及其衛(wèi)星RNA接種后侵染早期的本生煙葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜分析。其中,在基因芯片實(shí)驗(yàn)中,以未接種病毒的健康植物為對照,比較了 BBSV侵染、或BBSV與衛(wèi)星RNA共同侵染本生煙,以及在侵染后不同時(shí)間寄主植物基因的表達(dá)情況,共獲得4503個(gè)差異表達(dá)的基因。這些被激活的基因除了分布在與生物合成有關(guān)的核糖體(Ribosome)、蛋白酶體(Proteasome)、光合作用(Photosynthesis)等重要通路中,尤其值得關(guān)注的是一些與植物激素合成(Biosynthesis of plant hormones)或植物-病毒相互作用(Plant-pathogen interaction)等通路相關(guān)的基因表達(dá)量迅速上調(diào),而衛(wèi)星RNA的加入則使得這種上調(diào)變化減弱。為了彌補(bǔ)基因芯片無法檢測未知基因的局限和不足,進(jìn)一步采用了高通量RNA測序技術(shù)對差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測,以挖掘更多的可能參與抵抗BBSV侵染過程的植物基因。RNA測序分析結(jié)果與芯片雜交結(jié)果一致,即病毒侵染后植物體內(nèi)各種抗性基因及通路響應(yīng)顯著,衛(wèi)星RNA的加入對本生煙內(nèi)因BBSV侵染而產(chǎn)生的基因差異表達(dá)具有抑制作用。進(jìn)一步將BBSV與衛(wèi)星RNA共同侵染的樣品與BBSV單獨(dú)侵染的本生煙樣品進(jìn)行比較分析,結(jié)果表明衛(wèi)星RNA加重侵染癥狀可能與基因沉默(3個(gè)差異表達(dá)基因)、植物抗性基因(35個(gè)差異表達(dá)基因)、轉(zhuǎn)錄因子(47個(gè)差異表達(dá)基因)、受體蛋白(49個(gè)差異表達(dá)基因)、泛素化(34個(gè)差異表達(dá)基因)、生長素(17個(gè)差異表達(dá)基因)等相關(guān)途徑基因表達(dá)變化相關(guān),BBSV侵染引起這些基因的差異表達(dá)因衛(wèi)星RNA加入而受到抑制,從而減弱了本生煙對BBSV侵染的抗病響應(yīng)。為了深入了解衛(wèi)星RNA在以上過程中的作用,對植物基因沉默通路相關(guān)基因又進(jìn)行了分析驗(yàn)證。結(jié)果表明,BBSV侵染本生煙后,基因沉默通路中關(guān)鍵功能基因RDR6(RNA-directed RNA polymerase 6)、DCL2(Dicer-like protein 2)、AGO1(argonaute protein 1)、AGO2(argonaute protein 2)表達(dá)量上調(diào),推斷本生煙可能是通過上調(diào)這些基因的表達(dá)量以提高基因沉默效率從而增強(qiáng)植物抗病毒能力。與BBSV單獨(dú)侵染相比,衛(wèi)星RNA的加入抑制了AGO2表達(dá)量的上調(diào),由此推測衛(wèi)星RNA可能通過降低沉默通路關(guān)鍵基因的表達(dá)水平來降低植物抗性。另外,與未接種的健康植物相比,在AGO2表達(dá)量上調(diào)的同時(shí),檢測到miR403表達(dá)量下調(diào),鑒于AGO2是miR403的靶標(biāo)蛋白,miR403可以介導(dǎo)AGO1對AG02的降解,所以推測BBSV的侵染可能通過抑制miR403的表達(dá)來上調(diào)AGO2的表達(dá)量。然而,與BBSV單獨(dú)侵染相比,衛(wèi)星RNA的加入使AGO2的積累量下降,但miR403積累量也同時(shí)表現(xiàn)為更大程度的下降,說明衛(wèi)星RNA加入后植物對AGO2的調(diào)控還存在其他途徑。為了獲得較高可信度的轉(zhuǎn)錄譜分析結(jié)果,本論文還進(jìn)行了適用于病毒侵染本生煙實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)分析的內(nèi)參基因篩選工作。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)中BBSV侵染后本生煙內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的基因和文獻(xiàn)報(bào)道中常用的內(nèi)參基因信息,選取了 26個(gè)候選基因,通過qPCR檢測發(fā)病葉片中候選內(nèi)參基因的表達(dá)量,經(jīng)過geNorm、NormFinder和BestKeeper三個(gè)軟件分析,最終確定NbUP7和GBP為煙草壞死病毒A(TNV-A)、甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)、甜菜壞死黃脈病毒(BNYVV)、大麥條紋花葉病毒(BSMV)和馬鈴薯X病毒(PVX)五種病毒侵染本生煙后相對表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,可以用于qPCR分析。綜上所述,衛(wèi)星RNA可能通過抑制本生煙內(nèi)相關(guān)通路因BBSV侵染而產(chǎn)生的基因差異表達(dá),從而減弱本生煙對病毒的抗病響應(yīng),降低本生煙防御BBSV的能力,導(dǎo)致病毒侵染本生煙的發(fā)病癥狀加重。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S435.663

【參考文獻(xiàn)】

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1 席德慧;曹云鶴;郭立華;原雪峰;蔡祝南;韓成貴;李大偉;于嘉林;;甜菜黑色焦枯病毒新疆分離物基因組RNA的序列分析及侵染性cDNA克隆構(gòu)建[J];病毒學(xué)報(bào);2006年04期

2 蔣軍喜,張景鳳,車少臣,羊大進(jìn),于嘉林,蔡祝南,劉儀;甜菜黑色焦枯病毒經(jīng)甘藍(lán)油壺菌傳播的研究[J];江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1999年04期

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本文編號：1261678