本文關鍵詞：西瓜根系滲透脅迫下轉錄組與microRNA分析及相關基因功能研究

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【摘要】：干旱是影響作物產(chǎn)量和品質的重要環(huán)境因子之一。我國干旱和半干旱區(qū)域約占國土面積的50%。而在濕潤的地區(qū)也會遭受到季節(jié)性和周期性的干旱。在解決干旱問題的方法中,培育抗旱耐旱新品種是重要的手段之一。而抗旱耐旱新品種的培育就要求我們了解作物對干旱脅迫的響應和調控機制。根系在植物吸收水分、營養(yǎng)物質及感受水脅迫信號中發(fā)揮重要作用,同時也是受干旱影響最大的器官,故了解根系對干旱脅迫的響應和應對具有重要意義。西瓜[Citrullus lanatus(Thumb.)Matsum.Nakai.]是一種重要的水果型經(jīng)濟園藝作物,其栽培面積占世界蔬菜栽培面積的7%。西瓜整個生長期需要大量水分,季節(jié)性干旱及頻繁發(fā)生的自然干旱嚴重影響了西瓜的產(chǎn)量、品質,甚至整個西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。M08是一個經(jīng)鑒定較為抗旱的西瓜自交系。本研究以M08根系為材料,用20%PEG模擬干旱脅迫,采用Illumina Hiseq 2500平臺對脅迫后的根系進行轉錄組、miRNA及降解組測序和分析,其結果為了解西瓜根系響應、應對滲透脅迫機制和西瓜抗旱耐旱遺傳改良提供了基礎信息。同時對脯氨酸合成相關酶的活性及編碼基因表達模式進行了研究,明確了脯氨酸的長距離運輸方式,并將脯氨酸合成限速酶P5CS編碼基因轉擬南芥進行了功能研究。本研究主要結果如下:(1)采用Illumina Hiseq 2500平臺對20%PEG脅迫6 h的根系及對照進行轉錄組測序,共得到了32.99 Gb數(shù)據(jù),超過40M條長125bp的pair-end reads。有5246個差異表達基因,其中2753上調表達,2493下調表達。在差異表達基因中有5175個基因獲得注釋。GO分析結果顯示這些差異表達基因涉及到了信號傳遞、滲透調節(jié)、活性氧清除、轉錄因子、植物激素、蛋白合成和細胞分裂等過程。在KEGG分析中,825個差異表達基因可分到108個不同的通路中。核糖體、植物激素信號、植物-病原體互作、嘌呤代謝及淀粉和糖代謝等通路中包含了大部分差異表達基因,其中核糖體途徑被顯著改變。(2)采用Illumina Hiseq 2500測序平臺對西瓜根系PEG脅迫后其miRNA水平上的響應進行了研究,同時利用生物信息學預測和降解組測序的方法對測序得到的miRNA的靶基因進行了預測。在對照文庫S01、S02、S03和脅迫處理文庫S04、S05S06文庫中分別得到了14,662,351、14,263,084、15,767,557、16,743,057、16,615,676、13,354,601和27,618,848個clean reads,通過質量控制,每文庫的Clean Data均大于13.35M,且Q30值均大于91%。在6個樣品中總共預測到了1060個新miRNA,其長度以24 nt為主。對這1060個miRNA的靶基因進行預測,其中174個miRNA預測到了456個靶基因。在這預測到的456個靶基因中,有241個基因獲得了注釋信息。差異表達的miRNA有42,其中上調表達的為20個,下調為22個。在差異表達表達miRNA的75個靶基因中,只有14個基因得到了注釋。在降解組文庫中,共檢測到了66個靶基因降解位點和66個靶基因發(fā)生了降解。與miRNA測序預測的靶基因取交集,得到了28個共有靶基因,這28個共有靶基因涉及了SPL、HD-Zip轉錄因子及植物激素信號傳遞。(3)西瓜植株在PEG脅迫下,其莖和葉中脯氨酸含量逐漸增加,后在12 h下降;而在根中,在第3 h達到最大,后開始下降。脯氨酸合成相關酶的酶活性及其編碼基因的相對表達量結果表明,PEG脅迫下西瓜植株中脯氨酸合成以谷氨酸途徑為主,在2個P5CS編碼基因中,以Cla006553為主,Cla017928表達被抑制。P5CS活性變化與Cla006553相對表達量變化相似。OAT酶活性較小,而其編碼基因的表達在根、莖葉中均被抑制。截斷地上部和地下部分并進行干旱脅迫,其試驗結果表明葉是脯氨酸合成的主要場所,在脅迫下根中脯氨酸依靠葉中脯氨酸長距離運輸?shù)礁�。對Cla006553和Cla017928的啟動子驅動GUS的轉基因擬南芥脅迫后染色發(fā)現(xiàn),在擬南芥葉中Cla006553的啟動子活性最高,在根中活性低。而Cla017928的啟動子在脅迫后,根、葉中的活性均較低。這更進一步表明,PEG脅迫下西瓜主要以Cla006553編碼P5CS酶,脯氨酸以葉為主要合成器官。(4)克隆了西瓜自交系M08的P5CS酶兩個編碼基因:Cla006553和Cla017928。Cla006553的編碼序列長2166bp,編碼721個氨基酸;Cla017928的編碼序列長2145bp,編碼714個氨基酸。二者核酸和氨基酸序列之間相似性為分別為74.19%和77.12%。其蛋白含有谷氨酸激酶功能域、ATP結合區(qū)、NAD(P)H結合區(qū)、亮氨酸拉鏈、谷氨酰脫氫酶功能區(qū)(G5PR)等結構域和脯氨酸反饋抑制位點。轉Cla006553和Cla017928基因的擬南芥植株可顯著增加脯氨酸含量,具有較高的耐旱和耐鹽能力。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S651

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