本文關(guān)鍵詞：桔小實(shí)蠅piRNA通路相關(guān)基因tudor及海藻糖酶基因?qū)β殉舶l(fā)育影響的研究

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【摘要】：桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis (Hend el)是一種重要的果蔬害蟲(chóng),寄主與分布范圍廣,現(xiàn)已逐漸成為最為重要的柑橘害蟲(chóng)之一。桔小實(shí)蠅繁殖能力強(qiáng),成蟲(chóng)產(chǎn)卵于果實(shí)內(nèi),幼蟲(chóng)孵化后寄居果實(shí)內(nèi)取食,造成果實(shí)腐爛及落果。目前控制桔小實(shí)蠅的主要手段為性誘劑和化學(xué)殺蟲(chóng)劑的聯(lián)合應(yīng)用,但多地均報(bào)道該蟲(chóng)對(duì)多種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了抗藥性,因此亟需開(kāi)發(fā)新型高效殺蟲(chóng)劑以對(duì)桔小實(shí)蠅進(jìn)行持續(xù)防控。卵巢是昆蟲(chóng)雌性生殖系統(tǒng)的重要組織,直接關(guān)系著昆蟲(chóng)后代的繁衍。卵巢的發(fā)育調(diào)控與昆蟲(chóng)的種群控制密切相關(guān),相關(guān)領(lǐng)域的研究一直是昆蟲(chóng)發(fā)育學(xué)研究的熱點(diǎn),也是探索害蟲(chóng)控制新方法的重要途徑。本學(xué)位論文以桔小實(shí)蠅為研究對(duì)象,在對(duì)桔小實(shí)蠅卵巢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上,篩選和鑒定與卵巢發(fā)育相關(guān)的基因,解析這些基因的分子特性和功能,以期為以卵巢發(fā)育相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo)的新型殺蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ),主要研究結(jié)果如下：1.桔小實(shí)蠅卵巢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及卵巢發(fā)育相關(guān)基因定量分析轉(zhuǎn)錄組可以快速準(zhǔn)確的獲取生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本信息。采用Illumina Hiseq平臺(tái)對(duì)桔小實(shí)蠅羽化后不同日齡的成蟲(chóng)卵巢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。分析測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),共獲得contig 44,845條,所獲contig進(jìn)一步拼接為23,822個(gè)unigene, unigene平均長(zhǎng)度為1,116 bp,說(shuō)明該轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量較高。以E=10-5為閾值,分別有15,473、12,603、11,068、6,102和11,043個(gè)unigene匕對(duì)注釋到相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO)。對(duì)在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)的unigene進(jìn)行物種同源性分布分析,結(jié)果表明,這些unigene的同源分布主要集中于果蠅屬昆蟲(chóng)(79.5%),其中,13.68%的unigene與果蠅Drosophila virilis相關(guān)基因的同源性最高,其次為黑腹果蠅Drosophila melanogaster (11.87%)。對(duì)桔小實(shí)蠅卵巢中組裝出的unigene進(jìn)行GO分類(lèi)發(fā)現(xiàn),在59個(gè)功能組中,注釋unigene最多的3個(gè)功能組依次為“細(xì)胞過(guò)程”、“單有機(jī)體過(guò)程”和“細(xì)胞部分”,分別含有8,227(74.5%)、7,228(65.5%)和6,655(60.3%)個(gè)unigeneo注釋unigene最少的功能組為“蛋白標(biāo)記”和“受體調(diào)節(jié)活性”,均只包含1個(gè)unigene。對(duì)桔小實(shí)蠅卵巢中組裝出的unigene進(jìn)行COG分類(lèi)發(fā)現(xiàn),在25個(gè)功能組中,注釋unigene最多的功能組是“一般功能預(yù)測(cè)”,包含有2,653個(gè)unigene,注釋最少的功能家族為“核結(jié)構(gòu)”,僅包含2個(gè)unigene。GO和COG分類(lèi)結(jié)果初步反映了桔小實(shí)蠅卵巢轉(zhuǎn)錄組中基因的功能分布情況。在完成桔小實(shí)蠅卵巢轉(zhuǎn)錄組分析后,對(duì)與卵巢發(fā)育相關(guān)的通路基因進(jìn)行鑒定,共篩選出屬于11條通路的30個(gè)基因,包括37個(gè)unigene或contig。其中,屬于骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)信號(hào)通路的基因有2個(gè)、屬于鈣粘蛋白(E-cadherin)通路的基因有2個(gè)、屬于Notch通路的基因有2個(gè)、屬于piRNA通路的基因有4個(gè)、屬于胰島素信號(hào)通路的基因有4個(gè)、屬于信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)通路的基因有2個(gè)、屬于蛻皮激素(Ecdysone)信號(hào)通路的基因有5個(gè)、屬于脂質(zhì)消化與吸收(Fat digestion and absorption)通路的基因有4個(gè)、參與卵黃原和極細(xì)胞形成過(guò)程的基因各2個(gè)以及海藻糖代謝中的海藻糖酶基因1個(gè)。進(jìn)一步對(duì)其中的30個(gè)通路基因采用定量PCR技術(shù)分析其在桔小實(shí)蠅頭部、胸部、中腸、馬氏管、卵巢和脂肪體中的表達(dá)量,結(jié)果表明：BMP信號(hào)通路基因主要在中腸中表達(dá),鈣粘蛋白和JAK-STAT信號(hào)通路基因主要在馬氏管中表達(dá),Notch、piRNA通路和極細(xì)胞形成相關(guān)基因主要在卵巢中表達(dá),胰島素信號(hào)通路和蛻皮激素信號(hào)通路在各檢測(cè)的組織中均有較為一致的表達(dá)水平,脂質(zhì)代謝通路和卵黃原蛋白基因主要在脂肪體表達(dá),海藻糖酶基因在頭部、中腸和卵巢中高表達(dá)。不同通路基因在各組織器官的特異性表達(dá)暗示出這些基因潛在的生理功能,這對(duì)后續(xù)的基因功能驗(yàn)證研究具有指示意義。2.桔小實(shí)蠅piRNA通路相關(guān)基因的克隆與序列分析由于piRNA通路相關(guān)基因piwi、argonaute3、aubergine和tudor在桔小實(shí)蠅卵巢高表達(dá)以及該通路涉及小分子RNA的特異性,本研究選擇該通路基因進(jìn)行深入分析。基于桔小實(shí)蠅卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的unigene信息,克隆獲得了相關(guān)基因Bdpiwi (KR013230)、Bdago3 (KR013228)、Bdaub (KR013229)和 Bdtud (KR013231)的cDNA全長(zhǎng)序列。對(duì)這些基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和序列功能區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)這4個(gè)蛋白質(zhì)均不屬于膜蛋白,并且Bdpiwi、Bdago3和Bdaub具有非常相似的結(jié)構(gòu),只包含1個(gè)PAZ功能域和1個(gè)PIWI功能域,在2個(gè)功能域中共包含7個(gè)和4個(gè)活性位點(diǎn),并且在PIWI功能域中均含有5’末端RNA鏈錨定點(diǎn),預(yù)示這些基因與piRNA形成過(guò)程中RNA鏈的剪切存在密切聯(lián)系；對(duì)Bdtud基因的分析表明,該基因編碼的氨基酸序列含有10個(gè)Tudor功能域,并且在第2-10個(gè)功能域內(nèi)包含有4個(gè)二甲基化精氨酸結(jié)合位點(diǎn),這也預(yù)示著B(niǎo)dtud具有與PIWI家族蛋白進(jìn)行結(jié)合的能力。通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)的Piwi、Ago3和Aub進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)Piwi與Aub聚為簇,這兩個(gè)蛋白可能具有更高的同源性,而Ago3單獨(dú)為一簇,其分化程度較Piwi和Aub更大；對(duì)昆蟲(chóng)中tudor序列以及與其同源的3個(gè)Tudor功能域蛋白序列Spindle-E、Tudor-SN口Partner of P WI進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明,Tudor功能域蛋白中,tudor與 Partner of PIWI親緣關(guān)系較近,來(lái)源于同一點(diǎn),其次為T(mén)udor-SN,親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的為Spindle-E,說(shuō)明昆蟲(chóng)Tudor可能與Partner of PIWI具有相似的功能。通過(guò)對(duì)piRNA通路相關(guān)基因進(jìn)行序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析,初步探究了這些基因可能存在的功能,為后續(xù)的功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。3.基于RNAi技術(shù)的桔小實(shí)蠅piRNA通路相關(guān)基因的功能分析為深入探究桔小實(shí)蠅Bdtud基因在卵巢中的功能,采用RNAi技術(shù)抑制Bdtud基因的表達(dá)量,檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量并觀察表型變化情況。結(jié)果表明,注射Bdtud基因的dsRNA后,在桔小實(shí)蠅整蟲(chóng)中引起B(yǎng)dtud的沉默效率與對(duì)照比較并不明顯,但在卵巢中產(chǎn)生了明顯的沉默效果。同時(shí)在整蟲(chóng)和卵巢中亦引起B(yǎng)dpiwi、Bdago3和Bdaub表達(dá)量的下降。觀察注射dsRNA后成蟲(chóng)卵巢的發(fā)育狀況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射dsRNA后直徑小于0.6 mm的卵巢數(shù)顯著多于對(duì)照,而直徑大于或等于1.0mm的卵巢數(shù)顯著少于對(duì)照,說(shuō)明Bdtud在卵巢中表達(dá)量的下降引起卵巢發(fā)育滯后；注射dsRNA的雌成蟲(chóng)與正常雄蟲(chóng)進(jìn)行配對(duì),發(fā)現(xiàn)交配率顯著低于對(duì)照,且產(chǎn)卵量下降,表明由于卵巢發(fā)育滯后影響了交配率和產(chǎn)卵量；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)注射dsRNA后,極細(xì)胞形成相關(guān)基因Nanos的表達(dá)量顯著下調(diào),說(shuō)明抑制Bdtud的表達(dá)可能影響極細(xì)胞的正常形成�；谝陨辖Y(jié)果提出了Bdtud調(diào)控卵巢發(fā)育的理論模型：即Bdtud可能通過(guò)影響piRNA通路及極細(xì)胞形成共同維持卵巢的正常發(fā)育。上述研究結(jié)果揭示出Bdtud可能是一個(gè)潛在的調(diào)控桔小實(shí)蠅或其他害蟲(chóng)生殖發(fā)育的作用靶標(biāo)。4.桔小實(shí)蠅tudor基因干擾后差異基因表達(dá)譜分析為進(jìn)一步闡明Bdtud介導(dǎo)卵巢發(fā)育的分子機(jī)理,采用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)對(duì)dsTUDO R處理后的卵巢進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。結(jié)果顯示,對(duì)桔小實(shí)蠅進(jìn)行dsRNA處理后與對(duì)照相比分別有188和558個(gè)基因發(fā)生表達(dá)量的上調(diào)和下調(diào)。對(duì)差異基因進(jìn)一步篩選與比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)(Log2RPKM)超過(guò)5倍的上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)分別為4個(gè)和6個(gè)。另外有3個(gè)下調(diào)基因被注釋為表皮發(fā)育調(diào)控因子受體,暗示其在維持卵母細(xì)胞的分化中具有作用,并且在上調(diào)、下調(diào)基因中各存在1條unigene分別被注釋為GST和P450家族基因,其具體調(diào)控機(jī)理尚待研究。上述研究結(jié)果說(shuō)明干擾Bdtud基因表達(dá)使卵巢內(nèi)的眾多通路和基因產(chǎn)生了復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致卵巢發(fā)育滯后。這為進(jìn)一步明晰Bdtud介導(dǎo)的卵巢發(fā)育分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。5.桔小實(shí)蠅海藻糖酶基因的克隆及功能初探為研究海藻糖酶在卵巢發(fā)育中是否具有決定性的調(diào)控作用,基于轉(zhuǎn)錄組中的unigene信息,采用RACE結(jié)合PCR技術(shù)克隆得到桔小實(shí)蠅膜結(jié)合型海藻糖酶基因BdTre2的cDNA全長(zhǎng)序列,序列分析發(fā)現(xiàn)該基因具有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,并且存在2個(gè)海藻糖酶標(biāo)簽序列,證明其屬于膜結(jié)合型的海藻糖酶。對(duì)昆蟲(chóng)可溶性海藻糖酶及膜結(jié)合型海藻糖酶基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果顯示兩種類(lèi)型的海藻糖酶分別聚為一簇。進(jìn)一步采用RNAi技術(shù)分析桔小實(shí)蠅BdTre2的功能,發(fā)現(xiàn)注射dsRNA后BdTre2的沉默效率達(dá)到80%,說(shuō)明該基因能被有效沉默。RNAi處理后桔小實(shí)蠅體內(nèi)海藻糖含量增多,但處理后卵巢直徑未發(fā)生顯著變化,預(yù)示海藻糖酶基因?qū)坌?shí)蠅卵巢的供能具有一定的作用,但并非卵巢發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵基因。綜上所述,通過(guò)桔小實(shí)蠅卵巢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得了大量在卵巢表達(dá)的基因信息；采用定量PCR技術(shù)對(duì)篩選出的11條通路中的30個(gè)基因在桔小實(shí)蠅不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了解析；克隆獲得了piRNA相關(guān)通路基因及海藻糖酶基因,應(yīng)用RN Ai技術(shù)對(duì)這些基因的功能進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)干擾piRNA通路相關(guān)基因tudor的表達(dá)后引致卵巢發(fā)育滯后,繼而影響交配率和產(chǎn)卵量,其原因可能與piRNA的生成受阻有關(guān)；同時(shí),干擾tudor基因的表達(dá)也影響極細(xì)胞的正常發(fā)育,進(jìn)而對(duì)原始生殖細(xì)胞及生殖干細(xì)胞的正常形成產(chǎn)生影響,并導(dǎo)致卵巢發(fā)育異常。桔小實(shí)蠅海藻糖酶基因可能影響卵巢供能,但并非關(guān)鍵因素。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索與桔小實(shí)蠅卵巢發(fā)育的相關(guān)基因的功能以及基于雌性生殖調(diào)控為靶標(biāo)的有效控制提供了科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S433

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本文編號(hào)：1229775