本文關(guān)鍵詞：天蠶素的規(guī)模化制備及其在斷奶仔豬日糧中的應(yīng)用研究

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【摘要】：為了給消費(fèi)者提供優(yōu)質(zhì)綠色的動(dòng)物產(chǎn)品,同時(shí)提高我國(guó)畜產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力,研制抗生素或化學(xué)類生長(zhǎng)促進(jìn)劑的替代物是中國(guó)飼料添加劑工業(yè)面臨的一個(gè)重大課題。目前認(rèn)為抗生素替代品有很多,如植物提取物、微生態(tài)制劑、酶制劑以及抗菌肽等,抗菌肽的生物學(xué)特性:(1)生物學(xué)活性范圍廣;(2)作用迅速、效果穩(wěn)定;(3)不易產(chǎn)生耐藥性;(4)對(duì)包膜病毒、真菌、癌細(xì)胞等均有作用;(5)沒有藥物殘留。天蠶素是從蠶蛹中分離的,屬于首例發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物抗菌肽,在1980年,瑞典科學(xué)家G.Boman等人發(fā)現(xiàn)的,定名為cecropins。本論文主要篩選得到高效分泌表達(dá)天蠶素的枯草芽孢桿菌宿主菌及其中試發(fā)酵工藝優(yōu)化、天蠶素的發(fā)酵液分離純化和初步應(yīng)用試驗(yàn)。論文的主要結(jié)果如下:(1)天蠶素在不同枯草芽孢桿菌的表達(dá)含量的比較。將表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化入三株宿主菌株后,實(shí)現(xiàn)重組天蠶素異源表達(dá),然后用SDS-PAGE和高效液相法比較三株菌株cecropin AD表達(dá)量。經(jīng)SDS-PAGE和高效液相法分析,三株菌株都能產(chǎn)生分子量為3.8 k Da的小肽,但經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)重組cecropin AD在宿主菌WB800表達(dá)效率最高,含量達(dá)到826.72μg/ml。(2)將從實(shí)驗(yàn)室篩選得到的宿主菌WB800進(jìn)行中試發(fā)酵工藝優(yōu)化。本文以枯草芽孢桿菌WB800為供試菌株,依托實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)以Design-Expert響應(yīng)面分析軟件為基礎(chǔ),通過其Box-Behnken Design(BBD)來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法,通過p H值、通風(fēng)量、轉(zhuǎn)速三個(gè)因變量的分析比較,以最終天蠶素產(chǎn)量為唯一響應(yīng)值,通過設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,找出最佳發(fā)酵工藝條件,為CAD的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。通過實(shí)驗(yàn)我們可以得出,當(dāng)發(fā)酵液的p H值達(dá)到7.60,轉(zhuǎn)速達(dá)到230 r/min,其通風(fēng)量達(dá)到5.00L/h的時(shí)候,天蠶素表達(dá)量會(huì)達(dá)到一個(gè)理論最高值,即979.98μg/ml,通過三次驗(yàn)證實(shí)際含量能達(dá)到961.52μg/ml,可以進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。(3)以從第一章獲得的能高表達(dá)量天蠶素菌種WB800為宿主菌,以第二章優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵,獲得待純化的發(fā)酵液;根據(jù)天蠶素的理化性質(zhì)首先設(shè)計(jì)了純化路線;其次是在純化的每個(gè)步驟進(jìn)行純化填料的摸索、條件優(yōu)化;最后將整個(gè)純化工藝進(jìn)行貫通,純化出天蠶素的純品進(jìn)行檢測(cè)、鑒定。研究表明:發(fā)酵液經(jīng)過離子交換層析后收集到的樣品用反相色譜的方法檢測(cè)純度為69.5%,疏水層析后純度為87.4%,最終檢測(cè)天蠶素純品的純度為100%;純品對(duì)于G-與G+均有一定的抑制與殺滅作用。(4)將天蠶素飼料添加劑產(chǎn)品加到豬日糧中,觀察其對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響。選取體重為8.46±0.12 kg的杜×大×長(zhǎng)三元雜交豬360頭,采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì),分為4個(gè)處理,每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)(欄),每個(gè)重復(fù)(欄)15頭豬,對(duì)照組:基礎(chǔ)日糧(無藥物,玉米-豆粕型);藥物組:基礎(chǔ)日糧+25 mg/kg維吉尼亞霉素+100 mg/kg土霉素+60 mg/kg硫酸抗敵素(藥物以有效含量計(jì));天蠶素組:基礎(chǔ)日糧+400 mg/kg天蠶素;配伍組:基礎(chǔ)日糧+250 mg/kg天蠶素+50 mg/kg土霉素+20 mg/kg硫酸抗敵素(藥物以有效含量計(jì)),研究天蠶素對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和免疫功能的影響。結(jié)果表明,天蠶素組及配伍組較抗生素組及對(duì)照組在仔豬飼料轉(zhuǎn)化率方面均差異顯著(P0.05),在日增重及日采食量方面均有改善的趨勢(shì);在腹瀉率及豬瘟抗體水平方面,試驗(yàn)各組均顯著優(yōu)于對(duì)照組(P0.05),其中對(duì)于天蠶素組平均抗體阻斷率顯著優(yōu)于其余三個(gè)組(P0.05);天蠶素組在血清生化指標(biāo)BUN、GLU、TP及Ig G、Ig A方面有顯著改善作用(P0.05)。(5)在北京、河北、河南等規(guī)模化豬場(chǎng)推廣應(yīng)用中,在仔豬飼料轉(zhuǎn)化率方面、成活率和腹瀉率均取得良好應(yīng)用效果,每頭豬給養(yǎng)殖戶增加經(jīng)濟(jì)效益達(dá)13-16元。因此,天蠶素添加到保育豬飼料中可以部分替代吉他霉素、維吉尼亞霉素等抗G+飼用抗生素使用量和降低硫酸粘桿菌素使用量。綜上所述,通過對(duì)三株枯草芽孢桿菌篩選獲得了能高效表達(dá)天蠶素的菌株WB800,同時(shí)通過優(yōu)化發(fā)酵工藝獲得了能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的工藝條件,根據(jù)天蠶素特點(diǎn)摸索得到最適分離純化工藝,并獲取到100%純品。對(duì)斷奶仔豬的應(yīng)用表明,能有效減少或完全取代抗生素的使用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828.5

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