本文關(guān)鍵詞：葡萄抗病相關(guān)基因表達(dá)及抗黑痘病轉(zhuǎn)錄組研究

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【摘要】：葡萄(Vitis vinifera L.)是重要的經(jīng)濟(jì)水果之一,具有很高的生態(tài)和社會(huì)價(jià)值,而真菌性病害如葡萄黑痘病(Elsinoe ampelina(de Bary)Shear)等嚴(yán)重影響著葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)。許多理論和實(shí)踐證明,利用葡萄自身抗病資源,培育抗病新品種是控制葡萄真菌病害最經(jīng)濟(jì)、有效的措施。我國(guó)野生葡萄材料中蘊(yùn)藏著相當(dāng)豐富的抗病資源,其中毛葡萄(V.quinquangularis)商-24株系對(duì)多種葡萄病害均表現(xiàn)高抗性,但其抗病的分子機(jī)理尚不明確。本研究首先對(duì)病原菌誘導(dǎo)下中國(guó)野生毛葡萄商-24株系的抑制消減雜交文庫(kù)進(jìn)行了抗病相關(guān)基因的篩選和表達(dá)分析;其次通過(guò)RNA-Seq技術(shù)對(duì)比分析了黑痘菌誘導(dǎo)下抗病毛葡萄商-24株系和感病歐亞種葡萄紅地球在轉(zhuǎn)錄水平上的變化和差異,構(gòu)建了葡萄應(yīng)答黑痘菌脅迫的表達(dá)譜,篩選出了兩個(gè)抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族JASMONATE ZIM-DOMAIN(JAZ)家族和basic helix-loop-helix(bHLH)家族,對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和不同處理下的基因表達(dá)研究,取得如下主要結(jié)果:1、對(duì)課題組前期構(gòu)建的黑痘病和白粉病誘導(dǎo)的中國(guó)野生毛葡萄商-24株系SSH文庫(kù)進(jìn)行分析,從中篩選出183個(gè)葡萄抗黑痘病和87個(gè)抗白粉病相關(guān)基因,并對(duì)篩選出的20個(gè)葡萄抗黑痘病和13個(gè)抗白粉病相關(guān)候選基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析,包括8個(gè)代謝相關(guān)基因、2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、2個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、1個(gè)運(yùn)輸相關(guān)基因、9個(gè)防御相關(guān)基因和7個(gè)泛素化途徑相關(guān)基因以及4個(gè)未知功能基因。結(jié)果顯示,多數(shù)基因在抗病毛葡萄商-24株系中受病原菌誘導(dǎo)表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá),但在感病葡萄中表達(dá)量變化不明顯,表明這些基因可能參與葡萄對(duì)病原菌脅迫的響應(yīng)。2、分別以抗葡萄黑痘病的毛葡萄商-24株系和感黑痘病的歐亞種葡萄紅地球葉片為材料,對(duì)接種葡萄黑痘病菌6 h、12 h、24 h、48 h和72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的葉片及相應(yīng)的清水處理葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。40份葡萄材料測(cè)序共獲得高質(zhì)量reads約346 M,每份材料與參考基因組的比對(duì)率均在80%左右;采用RPKM法計(jì)算每個(gè)基因在各個(gè)樣本中的差異表達(dá)情況,共獲得差異表達(dá)基因3414個(gè),來(lái)自抗病毛葡萄商-24株系的有2246個(gè),來(lái)自感病葡萄紅地球的有2013個(gè),且上調(diào)表達(dá)基因較下調(diào)表達(dá)基因更多;對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO生物功能分類(lèi)發(fā)現(xiàn),來(lái)自抗病毛葡萄商-24株系和感病葡萄紅地球的差異基因分類(lèi)情況十分相似,其中參與脅迫響應(yīng)(response to stress)、細(xì)胞過(guò)程(cellular process)和代謝過(guò)程(metabolic process)的差異基因數(shù)量均為最多;對(duì)差異表達(dá)基因參與的代謝通路富集性分析表明,黑痘病菌在抗病和感病葡萄中誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因和顯著性富集的代謝通路大多相同,但是在抗病毛葡萄商-24株系中,抗性相關(guān)基因出現(xiàn)差異表達(dá)的時(shí)間和代謝通路發(fā)生富集的時(shí)間(6 h和24 h)較感病葡萄紅地球(48 h和72 h)的更早,揭示抗病毛葡萄商-24株系在響應(yīng)黑痘菌侵染中表現(xiàn)出一定的抗性特異性。3、利用半定量RT-PCR技術(shù)分析了前期從葡萄基因組中鑒定出的11個(gè)JAZ基因在根、莖、葉、卷須、花、果皮和胚珠等不同組織中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)JAZ基因在不同組織中的表達(dá)存在差異。對(duì)葡萄的11個(gè)JAZ基因在不同激素處理、高鹽(NaCl)和干旱脅迫及病原菌侵染后的表達(dá)結(jié)果分析表明,大多數(shù)JAZ基因參與對(duì)激素處理的響應(yīng),尤其是對(duì)MeJA和ABA處理的響應(yīng),表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達(dá);與MeJA和ABA相比,響應(yīng)SA和ET處理葡萄JAZ基因較少。大部分JAZ基因?qū)aCl或者干旱脅迫處理有響應(yīng),只有少數(shù)JAZ基因參與對(duì)病原菌侵染的響應(yīng)。采用同源克隆法從中國(guó)野生毛葡萄商-24株系中克隆了三個(gè)JAZ基因VqJAZ4、VqJAZ7和VqJAZ9的開(kāi)放閱讀框(ORF)。VqJAZ4的ORF長(zhǎng)861bp,與歐洲葡萄VvJAZ4核苷酸序列相似性為99.19%,編碼286個(gè)氨基酸殘基;VqJAZ7的ORF長(zhǎng)417bp,與歐洲葡萄VvJAZ7核苷酸序列相似性為95.8%,編碼138個(gè)氨基酸殘基;VqJAZ9的ORF長(zhǎng)807bp,與歐洲葡萄VvJAZ9核苷酸序列相似性為99.13%,編碼268個(gè)氨基酸殘基。4、在葡萄基因組中共鑒定出126個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子,根據(jù)多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以分為24個(gè)亞家族,屬于同一個(gè)亞家族的葡萄bHLH基因往往具有相似的蛋白質(zhì)及外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。同線(xiàn)分析表明串聯(lián)重復(fù)和大片段染色體復(fù)制是葡萄bHLH基因家族擴(kuò)增的主要方式;葡萄和擬南芥的許多bHLH基因存在同線(xiàn)關(guān)系,表明這些bHLH基因可能擁有共同的祖先。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)葡萄26個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子Ⅲ亞家族全部成員及部分Ⅳ亞家族成員在6種不同組織及不同激素和不同脅迫處理下的表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,葡萄bHLH轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中的表達(dá)模式存在差異;多數(shù)bHLH基因參與對(duì)ABA和MeJA處理的響應(yīng);部分bHLH基因?qū)Ω啕}(NaCl)或者干旱脅迫處理有響應(yīng),少數(shù)bHLH基因參與對(duì)病原菌侵染的響應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S436.631

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