本文關鍵詞：水稻感染RSV產(chǎn)生癥狀的蛋白質(zhì)組學分析及RNAi介導的抗RSV和RBSDV轉(zhuǎn)基因水稻研究

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【摘要】：水稻是全世界重要的糧食作物。多種水稻病毒的侵染會給水稻生產(chǎn)帶來了嚴重危害,其中水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)和水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是兩種重要的水稻病毒。感病水稻品種被RSV侵染后表現(xiàn)為心葉褪綠和捻轉(zhuǎn)、弧圈狀下垂并枯死,導致稻苗枯死。在水稻后期感染雖不枯死,但破壞水稻的生殖生長,造成抽穗不正常,嚴重影響水稻產(chǎn)量,但到目前為止,RSV誘導癥狀產(chǎn)生的機理尚不清楚。此外,種植抗病品種是防治水稻病毒病害經(jīng)濟有效的策略,由于缺乏常規(guī)抗性種質(zhì)資源,獲得遺傳改良水稻種質(zhì)資源成為迫切的問題。本研究利用基于i TRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)的比較蛋白質(zhì)組學分析了RSV侵染水稻前后的蛋白組差異,共鑒定了681個差異表達蛋白質(zhì)。生物信息學分析表明,在RSV侵染后水稻中表達下調(diào)70%以上差異蛋白質(zhì)主要位于葉綠體,參與了葉綠素代謝過程。其中葉綠素合成相關的鎂離子螯合酶(magnesium chelatase)的三個亞基中的CHLI(magnesium chelatase subunit I)和CHLD(magnesium chelatase subunit D)在m RNA和蛋白質(zhì)水平上均顯著減少,說明了RSV的侵染引起水稻葉片中的葉綠素合成受到抑制。在RSV侵染水稻后表達上調(diào)的蛋白質(zhì)中,感病葉片中天冬氨酸蛋白酶(Aspartic protease,ASP)表達量明顯增高,而在水稻發(fā)育過程中,天冬氨酸蛋白酶可以觸發(fā)水稻細胞的程序性死亡,說明了RSV侵染誘導天冬氨酸蛋白酶的上調(diào)表達有可能是引起心葉枯死的原因。此外,RSV侵染后,Bet v 1抗原家族蛋白質(zhì)、70 k Da熱激蛋白質(zhì)(Hot shock protein 70 k Da,HSP70)和超氧化物歧化酶觸發(fā)了植物的防御反應。酵母雙雜交進一步發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)RAP與RSV的病害特異蛋白(SP)在細胞內(nèi)互作,為揭示水稻條紋葉枯病癥狀形成的分子機制奠定了基礎。在利用轉(zhuǎn)基因技術獲得了由RSV外殼蛋白基因形成的發(fā)卡結構(RSV-pc3-hp RNA)介導抗RSV的轉(zhuǎn)基因水稻材料的基礎上,s RNA(small RNA)印跡分析檢測到與pc3基因序列互補的21 nt-24 nt si RNAs(small interfering RNAs),而RNAi產(chǎn)生的21 nt-24 nt si RNAs具有抗病活性,說明了發(fā)卡結構誘發(fā)了RNAi介導的抗病進程,從而導致特異性的si RNAs產(chǎn)生。與非轉(zhuǎn)基因水稻相比,轉(zhuǎn)基因水稻中AGO1B(Argonaute,AGO)、AGO1C、AGO1D、RDR4(RNA-dependent RNA polymerase,RDR)、SHL2(SHOOTLESS2)和DCL1A(Dicer-like,DCL)表達上調(diào),而AGO1A、AGO18和SHO1(SHOOT ORGANIZATION1)表達下調(diào)。在RSV侵染后轉(zhuǎn)基因水稻中AGO2表達上調(diào),而AGO1B、AGO1C、AGO1D、AGO11、AGO16、RDR2、RDR4、SHL2、DCL1A、DCL1C和DCL3B表達下調(diào)。這說明了RSV侵染可改變轉(zhuǎn)基因水稻中AGOs、RDRs和DCLs表達量。本研究將RSV外殼蛋白部分基因和RBSDV外殼蛋白部分基因組成基因(RSV-HCP-RBSDV-HS10),并將其基因插入到載體p MCG161上形成發(fā)卡結構(RSV-HCP-RBSDV-HS10-hp RNA),然后將發(fā)卡結構構建到改造過的載體p CAMBIA1301(去除潮霉素基因)上,獲得載體p CAMBIA1301-DB。采用雙菌雙質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化法等轉(zhuǎn)基因技術獲得了轉(zhuǎn)基因材料。在此基礎上,田間抗病篩選轉(zhuǎn)基因材料獲得了抗RBSDV和RSV的轉(zhuǎn)基因水稻后代,并且利用PCR檢測到T2、T3和T4代轉(zhuǎn)基因水稻中只含有RSV-HCP-RBSDV-HS10基因不含潮霉素基因,從而獲得無標記基因的抗RSV和RBSDV的轉(zhuǎn)基因水稻。Southern印跡分析明確了RSV-HCP-RBSDV-HS10基因整合到水稻基因組中,并且轉(zhuǎn)基因水稻含有多個拷貝的目的基因。s RNA印跡分析檢測到與RSV-HCP-RBSDV-HS10序列互補的21 nt-24 nt si RNAs,說明了RSV-HCP-RBSDV-HS10-hp RNA誘發(fā)RNAi介導抗病過程,導致特異性的si RNAs產(chǎn)生。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.4

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：1211085