本文關(guān)鍵詞：棉花雄性不育及黃萎病菌誘導(dǎo)相關(guān)microRNA的表達(dá)分析

  更多相關(guān)文章： 核雄性不育系 microRNAs 靶基因 黃萎病 棉花

【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類在真核生物體內(nèi)普遍存在的、長度約為19~25nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn),mi RNA作為基因表達(dá)中的一類負(fù)調(diào)控子,不僅能夠調(diào)控植物花器官的發(fā)育,而且在植物感受逆境脅迫而做出適應(yīng)性調(diào)整的過程中也發(fā)揮著重要的作用。因此探討miRNAs在雄性不育和抗黃萎病中的調(diào)控機(jī)制,可以為雄性不育在棉花雜種優(yōu)勢上的利用和棉花抗病育種提供新的途徑。本研究利用miRNA芯片、高通量測序和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法,鑒定棉花中的miRNAs及其靶基因,探討這些miRNAs在雄性不育和抗黃萎病中的調(diào)控機(jī)制。分析雄性不育相關(guān)以及脅迫誘導(dǎo)條件下棉花miRNA的差異表達(dá)情況,探討差異表達(dá)miRNA在花粉發(fā)育過程和抗逆反應(yīng)中所起的作用,為闡明棉花雄性不育的分子機(jī)理和抗黃萎病的調(diào)控途徑提供參考。主要結(jié)果如下:1.通過比較不育株和可育株花器官形態(tài)發(fā)現(xiàn),不育株花較小,雄蕊花絲極短、花藥不開裂,花粉完全敗育。在普通生物顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)不育株花粉在花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂時期出現(xiàn)異常,單核期開始出現(xiàn)大量小孢子裂解,花藥發(fā)育的全過程中均出現(xiàn)了小孢子裂解現(xiàn)象。2.分別提取不育株和可育株花粉造孢細(xì)胞時期、花粉母細(xì)胞時期和花粉粒時期花蕾RNA進(jìn)行microRNA芯片雜交試驗(yàn),結(jié)果顯示,在不育株花粉發(fā)育的三個時期,分別檢測到407、369、401條miRNAs,在可育株花粉發(fā)育的三個時期,分別檢測到146、286、343條miRNAs。其中,有54條miRNAs在不育株和可育株花粉中達(dá)到了顯著差異表達(dá)水平。另外,利用生物信息學(xué)方法預(yù)測得到35個miRNA的靶基因,其中大多數(shù)靶基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子,它們可能在花粉發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。3.為了檢測miRNA的靶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)狀況,利用Solexa測序?qū)γ藁ā?1A”不育株和可育株花粉母細(xì)胞時期花蕾進(jìn)行基因表達(dá)譜分析,我們共得到1,742條顯著差異表達(dá)的基因,其中有12個轉(zhuǎn)錄因子參與到花粉發(fā)育。通過對差異表達(dá)基因的途徑顯著性富集分析,鑒定了差異表達(dá)基因參與花粉發(fā)育過程中的主要代謝途徑,例如,戊糖和葡萄糖醛酸酯轉(zhuǎn)換途徑、類單萜類生物合成途徑、、倍半萜類生物合成途徑、淀粉蔗糖代謝途徑、半乳糖苷酶代謝途徑、亞麻酸代謝途徑、過氧物酶體代謝途徑等。miR159、miR319、miR172等家族miRNAs的靶基因(MYB、AP2等)在轉(zhuǎn)錄水平上出現(xiàn)顯著差異表達(dá),它們可能參與了基因轉(zhuǎn)錄、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝調(diào)控途徑。4.為了研究雄性不育相關(guān)miRNA在抗病反應(yīng)中的作用,以高抗黃萎病品種海島棉7124和易感品種冀棉11為材料,對棉花進(jìn)行黃萎病菌脅迫處理,利用高通量Solexa測序和生物信息學(xué)分析,鑒定得到140個已知miRNA和58個novel miRNA;篩選出了兩種棉花材料之間以及在不同處理?xiàng)l件下中差異表達(dá)的miRNA。共有26和19個miRNA在海島棉7124和冀棉11中受黃萎病菌侵染后誘導(dǎo)表達(dá)差異顯著,在正常生長和黃萎病菌浸染條件下,分別有35個和38個miRNA在兩種棉花栽培種之間表達(dá)量有顯著差異。其中,在花粉發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用的miR156、miR172、miR399、miR414等家族的miRNAs參與了棉花抗黃萎病反應(yīng)過程。5.以高抗黃萎病品種海島棉7124和易感品種冀棉11為材料,對棉花進(jìn)行黃萎病菌脅迫處理,利用降解組測序測序方法,鑒定得到棉花中107個miRNAs的靶基因,其中,SBP and SPL transcription factor、NAC domain-containing protein、Class III HD-Zip protein、AP2-like factor、F-box/RNI-like superfamily protein和growth-regulating factor(GRF)、MYB轉(zhuǎn)錄因子、leucine-rich repeat(LRR)-containing protein和LRR and NB-ARC domain-containing disease resistance-like protein等靶基因在棉花脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抵御黃萎病菌侵染過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：核雄性不育系 microRNAs 靶基因 黃萎病 棉花
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S562;S435.621.2
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 1 引言14-27
• 1.1 植物雄性不育系的類型14
• 1.2 棉花核雄性不育分子機(jī)理的研究14-16
• 1.2.1 棉花核雄性不育基因的定位14-15
• 1.2.2 棉花核雄性不育相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析15-16
• 1.3 棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育分子機(jī)理研究進(jìn)展16-18
• 1.3.1 細(xì)胞質(zhì)雄性不育分子機(jī)理及應(yīng)用16-17
• 1.3.2 育性恢復(fù)機(jī)理研究17-18
• 1.4 棉花光溫敏雄性不育分子機(jī)理研究進(jìn)展18-19
• 1.4.1 溫敏雄性不育18
• 1.4.2 光敏雄性不育18
• 1.4.3 光溫互作型雄性不育18-19
• 1.5 植物microRNA的研究19-20
• 1.5.1 植物miRNA的產(chǎn)生19
• 1.5.2 miRNA的作用機(jī)制19-20
• 1.6 植物開花及花器官發(fā)育相關(guān)的miRNA20-21
• 1.7 植物逆境脅迫響應(yīng)的miRNA21-26
• 1.7.1 miRNA與植物非生物脅迫23-25
• 1.7.1.1 miRNA與養(yǎng)分脅迫23-24
• 1.7.1.2 miRNA與低溫脅迫24
• 1.7.1.3 miRNA與干旱脅迫24-25
• 1.7.1.4 miRNA與鹽脅迫25
• 1.7.1.5 miRNA與其它非生物脅迫25
• 1.7.2 miRNA與植物生物脅迫25-26
• 1.8 本研究的目的和意義26-27
• 2 材料和方法27-38
• 2.1 試驗(yàn)材料27-30
• 2.1.1 植物材料與病原菌27
• 2.1.2 主要試劑27
• 2.1.3 引物序列27-29
• 2.1.4 主要儀器29
• 2.1.5 分析軟件29
• 2.1.6 分析所用的數(shù)據(jù)庫29-30
• 2.2 試驗(yàn)方法30-38
• 2.2.1 棉苗培養(yǎng)與病菌接種30
• 2.2.2 鑒別不育株和可育株30
• 2.2.3 鑒定不育花粉的敗育時期30
• 2.2.4 棉花總RNA的提取和檢測30-31
• 2.2.5 miRNA芯片試驗(yàn)31-32
• 2.2.6 預(yù)測miRNA的靶基因32
• 2.2.7 數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）分析32-33
• 2.2.8 小分子RNA文庫的構(gòu)建33
• 2.2.9 小分子RNA的測序33
• 2.2.10 小分子RNA文庫的數(shù)據(jù)分析33-34
• 2.2.11 降解組試驗(yàn)流程34-35
• 2.2.12 降解組測序數(shù)據(jù)分析35-36
• 2.2.13 qRT-PCR36-38
• 2.2.13.1 miRNA qRT-PCR36-37
• 2.2.13.2 普通基因qRT-PCR37-38
• 3 結(jié)果和分析38-70
• 3.1 鑒別不育株和可育株38
• 3.2 不育花粉的敗育時期38-39
• 3.3 microRNA芯片實(shí)驗(yàn)分析39-46
• 3.3.1 棉花 21A不育株和可育株miRNA差異表達(dá)分析39-41
• 3.3.2 qRT-PCR驗(yàn)證分析41-42
• 3.3.3 miRNA的靶基因預(yù)測42-46
• 3.4 DGE結(jié)果分析46-50
• 3.4.1 DGE初步分析結(jié)果46
• 3.4.2 棉花不育株和可育株差異表達(dá)基因的篩選46-47
• 3.4.3 參與花粉發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄因子47
• 3.4.4 差異表達(dá)基因參與的主要代謝途徑47-49
• 3.4.5 qRT-PCR驗(yàn)證DGE分析結(jié)果49-50
• 3.5 黃萎病菌侵染條件下棉花miRNA的差異表達(dá)分析50-62
• 3.5.1 小RNA測序的初步分析結(jié)果50-52
• 3.5.2 鑒定棉花miRNA52-59
• 3.5.3 黃萎病菌誘導(dǎo)下棉花miRNA的差異表達(dá)59-61
• 3.5.4 qRT-PCR驗(yàn)證小RNA測序結(jié)果61-62
• 3.6 降解組測序結(jié)果分析62-70
• 3.6.1 降解組測序初步分析結(jié)果62-63
• 3.6.2 棉花miRNA靶基因鑒定63-70
• 4 討論70-74
• 4.1 miRNA在花粉發(fā)育過程中的作用70-71
• 4.2 棉花 21A不育株和可育株花粉發(fā)育早期的差異表達(dá)基因71-72
• 4.3 黃萎病菌侵染條件下棉花miRNA的差異表達(dá)72
• 4.4 降解組測序技術(shù)為檢測植物miRNA靶基因提供了新方法72-73
• 4.5 進(jìn)一步的研究設(shè)想73-74
• 5 結(jié)論74-76
• 參考文獻(xiàn)76-85
• 致謝85-86
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況86

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 齊利枝;生冉;閆素梅;趙艷麗;;乙酸濃度對奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯含量及瘦素和過氧化物酶增殖物激活受體γ基因表達(dá)量的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年07期

2 王秀美;侯先志;敖長金;高民;考桂蘭;高愛武;蘭儒冰;塔娜;;三維模式下培養(yǎng)時間對奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白基因表達(dá)的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年07期

3 張冬梅;侯先志;楊金麗;高愛武;王海榮;考桂蘭;;飼糧能氮限飼與補(bǔ)償對蒙古羔羊肝臟重量、肝細(xì)胞增殖和增肥及生長激素受體、類胰島素生長因子基因表達(dá)量的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年07期

4 倪娟;李珍;薛京倫;汪旭;;表沒食子兒茶素沒食子酸酯對人成淋巴細(xì)胞株hMLH1和hMSH2 mRNA表達(dá)的影響[J];癌變·畸變·突變;2013年04期

5 鄭旭青;代天星;林曉敏;熊浩;楊海弟;;KCNJ10通道蛋白在C57BL/6J小鼠耳蝸的年齡相關(guān)性表達(dá)及與聽力關(guān)系[J];中國耳鼻咽喉頭頸外科;2013年08期

6 文惠方;蔣春梅;張尚弟;車團(tuán)結(jié);黃超杰;趙峰;;宮腔脫落細(xì)胞中p53、ki-67、bcl-2、bax基因的表達(dá)及意義[J];中國婦產(chǎn)科臨床雜志;2013年05期

7 孫敏敏;劉含亮;王紅衛(wèi);孟曉;王紀(jì)亭;萬文菊;;酵母鉻對尼羅羅非魚生長和糖代謝的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年09期

8 孫衍昶;郭t$t$;賽克;王翦;王潔;陳芙蓉;張宗平;陳忠平;;MicroRNA-181b提高U87細(xì)胞對VM-26的敏感性研究[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2013年02期

9 朱鐵錘;;NLRP3在馬兜鈴酸致腎損傷小鼠腎臟組織中的表達(dá)及其意義[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年05期

10 李欣;徐波;;中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動對心臟局部Ang II及AT_1R表達(dá)的影響[J];北京體育大學(xué)學(xué)報;2013年08期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙海霞;Ying Li;Yuzhong Wang;Jing Zhang;Xiaoming Ouyang;Renxiu Peng;Jing Yang;;蜈蚣糖肽抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性的研究(英文)[A];第十一屆全國博士生學(xué)術(shù)年會（生物醫(yī)藥專題）論文集（上冊，大會報告）[C];2013年

2 王志剛;嚴(yán)志;章必成;饒智國;余麗芳;劉健;高建飛;;基于芯片數(shù)據(jù)的隨機(jī)森林算法鑒定結(jié)腸癌生物標(biāo)記物(英文)[A];第四屆湖北省抗癌協(xié)會青年委員會學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2012年

3 Ruiwen Fan;Shanshan Yang;Zhanquan Shi;Kaiyuan Ji;Xiaoyun Jia;Jianbo Yao;George W Smith;Changsheng Dong;;Identification of a novel miRNA important for melanogenesis in alpaca(Lama Pacos)[A];2013中國駝業(yè)進(jìn)展[C];2013年

4 郭翔羽;劉璇;徐仙洲;吳蒙;張旭;李強(qiáng);劉文嬌;張毅;王雅春;俞英;;牛DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a/3b基因(DNMT3a/3b)的表達(dá)對肉質(zhì)性狀的影響[A];《第八屆中國牛業(yè)發(fā)展大會》論文集[C];2013年

5 王曉珂;趙健亞;劉天娥;陳致飛;張璇;王春;陳剛;;白藜蘆醇對高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖易感和肥胖抵抗大鼠體重的影響及相關(guān)機(jī)制[A];2013中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集（第七卷）[C];2013年

6 曾清華;周箐;康秀華;;血清microRNA的檢測及在肺癌診斷中應(yīng)用的進(jìn)展[A];江西省第二次中西醫(yī)結(jié)合呼吸疾病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2012年

7 Huang Qiang;Gong Yuehua;Wei Anqing;Peng Xiaoling;;Effects of hBD-3 on Staphylococcus aureus biofilm formation-regulating genes dltB and icaA genes[A];江西省第八次中西醫(yī)結(jié)合危重病、急救醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

8 田，

本文編號：1125192