本文關(guān)鍵詞：調(diào)控大豆E1基因表達的分子機理研究

  更多相關(guān)文章： 大豆 E1基因 表達特性 順式作用元件 開花期 B3結(jié)構(gòu)域

【摘要】：大豆生育期基因E1主要調(diào)控大豆的開花期及成熟期。本研究擬在對E1啟動子區(qū)域的分子信息學研究的基礎(chǔ)上,對E1基因的表達日節(jié)律變化及品種的E1基因表達的特點等進行相關(guān)研究,揭示E1基因表達的調(diào)控機理與E1基因的功能。主要研究結(jié)果如下:1.明確了大豆E1基因的表達節(jié)律研究通過每2小時取樣來研究E1基因的日節(jié)律變化規(guī)律,在長日照條件下,E1基因的表達呈現(xiàn)雙峰型,第一個高峰為黎明(光照)后2小時,第二個高峰的出現(xiàn)時間與其一致,為光照后16小時(為光照和黑暗的交替時間點)。相應(yīng)地E1基因表達的日節(jié)律出現(xiàn)兩個低谷,分別是光照后8~12小時和20~24小時。與之前的研究(Xia等,2012a)相比,第一高峰出現(xiàn)的時間提前了2個小時左右,這種差異可能是來自于取樣間隔時間上的差異。通過連續(xù)光照及連續(xù)黑暗試驗表明,光照條件能夠促進E1基因的表達量,相反連續(xù)的黑暗條件能抑制E1基因的表達,致使其表達極低。長日照條件下E1基因的表達量的雙峰型日節(jié)律變化規(guī)律及長短日照條件下表達量的巨大差別,主要受光反應(yīng)調(diào)控,同時亦受制于生物鐘節(jié)律。2.對E1基因上游序列進行生物信息學分析和5’側(cè)翼序列缺失表達分析及酵母單雜交篩選上游結(jié)合因子對大豆E1基因及其兩個同源基因的5’側(cè)翼序列進行生物信息學分析,確定與光反應(yīng)及生物鐘節(jié)律相關(guān)的順式作用元件是研究E1基因調(diào)控的基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個拷貝的上游序列-326bp~-1bp相似性大于85%。將E1基因5’側(cè)翼序列的不同區(qū)段連接植物表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥,結(jié)果顯示在E1基因上游-288bp~-1bp的區(qū)段就存在光反應(yīng)特性。試驗以E1基因和其兩個同源基因相似性最大的-326bp~-1bp區(qū)段除去5’UTR序列-157bp~-1bp后的-326bp~-154bp區(qū)段為重點序列構(gòu)建誘餌載體進行酵母單雜交試驗,經(jīng)酵母自激活檢驗后,以E1基因上游的兩區(qū)段-288bp至-154bp與-364bp至-257bp序列為誘餌,利用酵母單雜交技術(shù)來篩選大豆的基因表達文庫,鑒定出與其相互作用的結(jié)合蛋白。對候選結(jié)合蛋白進一步鑒定及相關(guān)的作用機理研究對明確E1基因的調(diào)控機理具有重要的意義。3.研究了不同遺傳因素對E1基因表達的影響本研究以Kariyutaka(E1,E2-in,e3-T,e4)×墾豐18(E1,e2-ns,E3-Ha,E4)雜交群體后代為試驗材料,在哈爾濱試驗田(45o70'N,126o64'E)和海倫試驗基地(47o26'N,126o38'E)種植,研究不同的E2、E3和E4的基因型組合對E1基因表達量的影響。試驗結(jié)果顯示,E1基因的表達豐度與開花期顯著相關(guān),在哈爾濱和海倫地區(qū),E2、E3和E4基因為隱性純合基因型的植株中E1基因表達量高于顯性純合植株中E1基因的表達量。單因素方差分析結(jié)果顯示,在哈爾濱地區(qū),E3基因和E4基因?qū)1基因表達量的影響小于E2基因的作用;而在較高緯度的海倫地區(qū),E3基因和E4基因?qū)1基因表達量的影響大于E2基因的作用。試驗說明E1基因的表達量直接影響植物開花期,而包括E2、E3、E4和未知基因在內(nèi)的遺傳因素可能通過調(diào)控E1基因的表達量來間接調(diào)控大豆開花時間。4.研究了E1基因突變型e1-b3a的亞細胞定位并進行功能驗證在煙黃3號品種中發(fā)現(xiàn)了一個E1基因的新型基因型,B3結(jié)構(gòu)域的中間位置發(fā)生了5bp突變,并產(chǎn)生終止密碼子,定名為e1-b3a。在哈爾濱地區(qū),e1-b3a的開花期較E1基因型提前30天,在淮安地區(qū)約提前10天。亞細胞定位研究表明,e1-b3a蛋白主要定位于細胞核中,這一亞細胞定位特性與E1蛋白相似而不同于e1-as蛋白。對e1-b3a基因型的相關(guān)研究,證明了B3結(jié)構(gòu)域?qū)1基因的生物學功能具有重要作用。在大豆品種中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了E1基因具有多個基因型,說明E1位點經(jīng)歷了較強的自然選擇與人工選擇。本研究揭示了E1基因的中樞調(diào)節(jié)功能,E1基因的多種功能相異的基因型及其不同的表達水平均影響著大豆的開花期。以E1基因的為中心的大豆生育期基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)賦予大豆品種具有能夠適應(yīng)不同的緯度及生態(tài)環(huán)境的光周期長度的生態(tài)適應(yīng)性。
【關(guān)鍵詞】：大豆 E1基因 表達特性 順式作用元件 開花期 B3結(jié)構(gòu)域
【學位授予單位】：中國科學院研究生院（東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所）
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S565.1
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一章 緒論14-27
• 第一節(jié) 選題背景與意義14-16
• 第二節(jié) 國內(nèi)外研究進展16-27
• 一、植物光周期途徑及其分子調(diào)控研究進展16-20
• （一）植物光周期途徑是重要的開花調(diào)控途徑16
• （二）光周期反應(yīng)與大豆生長適應(yīng)性相關(guān)16-18
• （三）光周期途徑分子調(diào)控機制研究進展18-20
• 二、大豆生育期基因的功能和QTL定位20-21
• （一）大豆生育期基因的功能20
• （二）大豆生育期基因的QTL定位20-21
• 三、大豆生育期相關(guān)基因的分子克隆21-23
• （一）大豆生育期E1 基因的分子克隆21-22
• （二）大豆生育期E2 基因的分子克隆22-23
• （三）大豆光敏色素基因E3 和E4 基因的分子克隆23
• 四、植物啟動子研究進展23-27
• （一）啟動子的種類23-24
• （二）啟動子的順式作用元件24-25
• （三）植物基因光反應(yīng)元件25-27
• 第二章 大豆E1 基因的表達節(jié)律研究27-34
• 第一節(jié) 材料與方法27-29
• 一、試驗材料和材料處理27
• 二、試驗方法27-29
• 第二節(jié) 試驗結(jié)果和分析29-33
• 一、總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄29-31
• 二、PCR檢測31-33
• 第三節(jié) 本章小結(jié)33-34
• 第三章大豆E1 基因上游序列分析及酵母單雜交篩選上游結(jié)合因子34-69
• 第一節(jié) 材料與方法34-50
• 一、試驗材料34-38
• （一）載體構(gòu)建相關(guān)材料34-36
• （二）轉(zhuǎn)化擬南芥相關(guān)材料36-37
• （三）酵母單雜交相關(guān)材料37-38
• （四）生物軟件和數(shù)據(jù)庫38
• 二、試驗方法38-50
• （一）載體構(gòu)建38-42
• （二）轉(zhuǎn)化擬南芥42-44
• （三）轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達分析44-46
• （四）酵母單雜交篩庫46-50
• 第二節(jié) 試驗結(jié)果與分析50-67
• 一、E1 基因上游序列生物信息學分析50-59
• （一）E1 基因上游序列比對50-56
• （二）E1 基因上游序列順式作用元件分析56-59
• 二、大豆E1 基因 5’側(cè)翼序列缺失表達分析59-63
• （一）不同區(qū)段植物表達載體的構(gòu)建59-60
• （二）凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌60-61
• （三）擬南芥抗性植株的篩選61-62
• （四）轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達分析62-63
• 三、酵母單雜文庫篩選63-67
• （一）誘餌載體構(gòu)建63-64
• （二）誘餌載體自激活驗證及 3-AT濃度的確定64-65
• （三）陽性克隆確定和測序65-67
• 第三節(jié) 本章小結(jié)67-69
• 第四章 不同遺傳背景影響E1 基因表達量69-85
• 第一節(jié) 材料與方法69-72
• 一、試驗材料69-70
• （一）植物材料69
• （二）試驗試劑69-70
• （三）數(shù)據(jù)分析軟件70
• 二、試驗方法70-72
• （一）開花期的調(diào)查70
• （二）DNA提取70-71
• （三）RNA提取及檢測71
• （四）qRT-PCR檢測E1 基因表達量71
• （五）E2、E3 和E4 基因的基因型鑒定71-72
• （六）數(shù)據(jù)分析72
• 第二節(jié) 結(jié)果與分析72-83
• 一、E1 基因表達量與開花期的關(guān)系72-74
• （一）E1（e1-as）基因表達量與開花期呈負相關(guān)72-74
• （二）雜交群體中E1 基因表達量與開花期呈負相關(guān)74
• 二、不同E2、E3、E4 基因型與E1 基因表達量的關(guān)系74-81
• （一）不同基因型組合的植株中E1 基因的表達量74-75
• （二）E2、E3、E4 基因型與E1 基因表達量的關(guān)系75-78
• （三）不同E3、E4 基因型組合與E1 基因表達量的關(guān)系78-79
• （四）不同E2、E3、E4 基因型與開花期的關(guān)系79-81
• 三、其他開花基因表達量與E1 基因的表達量和開花期的關(guān)系81-83
• 第三節(jié) 本章小結(jié)83-85
• 第五章 e1-b3a亞細胞定位及功能驗證85-94
• 第一節(jié) 材料和方法85-87
• 一、試驗材料85
• 二、試驗方法85-87
• （一）e1-b3a基因型的鑒定85
• （二）e1-b3a亞細胞定位85-86
• （三）開花期的調(diào)查86
• （四）數(shù)據(jù)分析86-87
• 第二節(jié) 試驗結(jié)果與分析87-93
• 一、e1-b3a基因型及CAPS標記87-89
• （一）e1-b3a等位變異結(jié)構(gòu)分析87-88
• （二）e1-b3a基因型CAPS標記88-89
• 二、e1-b3a的亞細胞定位89
• 三、e1-b3a等位變異對開花期的影響89-93
• 第三節(jié) 本章小結(jié)93-94
• 討論94-102
• 結(jié)論102-103
• 參考文獻103-111
• 發(fā)表文章目錄111-112
• 致謝112-113

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本文編號：1097135