本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)cry2A和cry1C基因水稻對(duì)意大利蜜蜂的生態(tài)安全性

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)Bt基因水稻 意大利蜜蜂 生態(tài)安全 非靶標(biāo)影響 PCR-DGGE

【摘要】：蜜蜂是重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)性昆蟲,其作為重要的指示性物種被用于轉(zhuǎn)基因抗蟲植物環(huán)境安全評(píng)估中。本研究系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了分別表達(dá)Cry2A和Cry1C蛋白的兩種抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻新品系T2A-1和T1C-19對(duì)意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)幼蟲和成蟲的潛在影響。獲得研究結(jié)果如下:1.基于已報(bào)道的幼蟲人工飼料及飼喂方法,本研究發(fā)展了一種簡(jiǎn)單、靈敏的評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)幼蟲直接毒性影響的試驗(yàn)技術(shù),并采用已知對(duì)蜜蜂幼蟲具有毒性的大豆胰蛋白酶抑制劑SBTI作為陽(yáng)性化合物,驗(yàn)證了所發(fā)展試驗(yàn)體系的有效性和靈敏性。2.采用所構(gòu)建的試驗(yàn)體系,評(píng)價(jià)了取食高劑量的Cry2A及Cry1C蛋白對(duì)意蜂幼蟲的潛在毒性,并以SBTI為陽(yáng)性對(duì)照,牛血清蛋白BSA為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示:分別取食混入純Cry1C(50μg/g)、Cry2A(400μg/g)或BSA(400μg/g)的人工飼料后,2日齡幼蟲的存活率和生長(zhǎng)發(fā)育沒有受到影響;且中腸內(nèi)總蛋白酶、類胰蛋白酶、氨肽酶和α-乙酸萘酯酯酶活性也沒有顯著變化;組織切片顯示幼蟲中腸表皮膜沒有受到破壞。而取食了含有SBTI(1 mg/g)的人工飼料后,2日齡幼蟲的存活率顯著下降,發(fā)育歷期顯著延長(zhǎng);中腸主要蛋白酶和解毒酶的活性也受到顯著影響。通過PCR-DGGE分析也沒有發(fā)現(xiàn)Cry2A(400μg/g)及Cry1C(50μg/g)蛋白對(duì)腸道細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果說明了意大利蜜蜂幼蟲對(duì)這兩種Cry蛋白不敏感。3.評(píng)價(jià)了兩種轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系T2A-1和T1C-19花粉對(duì)意大利蜜蜂幼蟲的潛在影響。分別將T2A-1和T1C-19水稻花粉按照0.5%(w:w)的比例直接添加至人工飼料中飼喂2日齡幼蟲,發(fā)現(xiàn)雖然取食Bt花粉對(duì)蜜蜂幼蟲中腸蛋白酶和解毒酶的生物活性有一定影響,但對(duì)蜜蜂幼蟲的生命表參數(shù)如存活率、發(fā)育歷期和老熟幼蟲體重沒有顯著影響。4.將純Cry2A和Cry1C蛋白分別以400μg/g和50μg/g的濃度加入到50%糖水中飼喂意蜂成蜂,并以SBTI(1 mg/g和10 mg/g)為陽(yáng)性對(duì)照,BSA(400μg/g)為陰性對(duì)照,50%糖水為空白對(duì)照。飼喂試驗(yàn)持續(xù)5周后,在Cry1C、Cry2A或BSA處理中,成蜂存活率和王漿腺腺泡直徑均沒有受到顯著影響;中腸內(nèi)的總蛋白酶、類胰蛋白酶、氨肽酶和α-乙酸萘酯酯酶活性均沒有顯著變化。而高濃度SBTI處理的成蜂存活率明顯下降;低濃度SBTI處理中成蜂的存活率降低,王漿腺腺泡直徑明顯減小,且中腸主要酶活性也發(fā)生顯著變化。PCR-DGGE分析顯示:分別取食Cry2A和Cry1C蛋白5天、10天和15天后,意大利蜜蜂成蜂中腸的菌群結(jié)構(gòu)也無明顯變化。5.將水稻花粉、蜂蜜、水按5:4:1混勻飼喂意大利蜜蜂成蜂10天后,發(fā)現(xiàn)取食Bt水稻花粉的成蟲存活率、王漿腺發(fā)育、中腸主要蛋白酶和解毒酶的活性與取食非Bt花粉意蜂相比均無顯著差異。6.本研究試驗(yàn)結(jié)果說明:種植轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻T2A-1和T1C-19不會(huì)對(duì)意大利蜜蜂帶來影響。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)Bt基因水稻 意大利蜜蜂 生態(tài)安全 非靶標(biāo)影響 PCR-DGGE
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S511;S891.5
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文縮略表13-14
• 第一章 引言14-24
• 1.1 轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展現(xiàn)狀14-17
• 1.1.1 轉(zhuǎn)基因作物種植情況14-16
• 1.1.2 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻研究進(jìn)展16-17
• 1.2 抗蟲轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)程序17
• 1.3 抗蟲轉(zhuǎn)基因植物對(duì)蜜蜂類影響的研究進(jìn)展17-23
• 1.3.1 蜜蜂類昆蟲概述17-18
• 1.3.2 對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究18-20
• 1.3.3 對(duì)中腸酶活性影響的研究20-21
• 1.3.4 對(duì)腸道微生物影響的研究21-22
• 1.3.5 對(duì)蜜蜂行為的影響22-23
• 1.4 研究背景、內(nèi)容及意義23-24
• 1.4.1 研究背景23
• 1.4.2 研究?jī)?nèi)容23
• 1.4.3 研究意義23-24
• 第二章 Bt蛋白對(duì)意大利蜜蜂幼蟲的潛在影響24-37
• 2.1 材料和方法24-25
• 2.1.1 供試?yán)ハx24
• 2.1.2 供試試劑24-25
• 2.1.3 主要儀器25
• 2.2 試驗(yàn)內(nèi)容25-29
• 2.2.1 意大利蜜蜂幼蟲人工飼料制備25-26
• 2.2.2 意蜂幼蟲人工飼養(yǎng)方法26
• 2.2.3 蜜蜂幼蟲取食不同濃度SBTI的生物學(xué)反應(yīng)26
• 2.2.4 Bt蛋白對(duì)蜜蜂幼蟲的毒性影響26-29
• 2.2.4.1 蜜蜂幼蟲生命表參數(shù)觀察26-27
• 2.2.4.2 蜜蜂幼蟲Bt蛋白攝取量檢測(cè)27
• 2.2.4.3 Cry蛋白的生物活性檢測(cè)27
• 2.2.4.4 取食Cry蛋白對(duì)蜜蜂幼蟲消化道酶活性影響27-28
• 2.2.4.5 組織病理學(xué)試驗(yàn)28-29
• 2.3 數(shù)據(jù)分析29
• 2.4 結(jié)果與分析29-35
• 2.4.1 蜜蜂幼蟲對(duì)SBTI的劑量反應(yīng)29
• 2.4.2 Bt蛋白對(duì)蜜蜂幼蟲的毒性29-35
• 2.4.2.1 生命表參數(shù)影響29
• 2.4.2.2 蜜蜂幼蟲Bt蛋白的攝取量29-32
• 2.4.2.3 Bt蛋白生物活性32
• 2.4.2.4 蜜蜂幼蟲腸道酶活性32-34
• 2.4.2.5 Cry蛋白對(duì)蜜蜂幼蟲組織病理學(xué)影響34-35
• 2.5 討論35-37
• 第三章 兩種Bt水稻花粉對(duì)意大利蜜蜂幼蟲的潛在影響37-43
• 3.1 材料和方法37-38
• 3.1.1 供試?yán)ハx37
• 3.1.2 供試試劑37-38
• 3.1.3 供試儀器38
• 3.1.4 供試花粉38
• 3.2 試驗(yàn)內(nèi)容38-39
• 3.2.1 意大利蜜蜂幼蟲花粉  人工飼料的制備38-39
• 3.2.2 生命表參數(shù)試驗(yàn)39
• 3.2.3 意蜂幼蟲對(duì)Bt蛋白的攝取量測(cè)定39
• 3.2.4 酶活測(cè)定試驗(yàn)39
• 3.3 統(tǒng)計(jì)分析39
• 3.4 結(jié)果分析39-41
• 3.4.1 生命表參數(shù)39-40
• 3.4.2 蜜蜂幼蟲對(duì)Bt蛋白的攝取量40
• 3.4.3 意大利蜜蜂幼蟲腸道酶活性測(cè)定40-41
• 3.5 討論41-43
• 第四章 Bt蛋白及Bt花粉對(duì)意大利蜜蜂成蟲的毒性影響43-57
• 4.1 材料方法43-44
• 4.1.1 供試?yán)ハx43
• 4.1.2 供試花粉43-44
• 4.1.3 供試試劑44
• 4.2 Bt純蛋白試驗(yàn)44-45
• 4.2.1 工蜂存活率測(cè)定44
• 4.2.2 王漿腺腺泡直徑測(cè)定試驗(yàn)44-45
• 4.2.3 意蜂中腸酶活性測(cè)定試驗(yàn)45
• 4.2.4 Bt蛋白攝取量分析45
• 4.3 Bt花粉試驗(yàn)45-46
• 4.3.1 存活率測(cè)定試驗(yàn)45-46
• 4.3.2 王漿腺腺泡直徑測(cè)定試驗(yàn)46
• 4.3.3 意蜂中腸酶活性測(cè)定試驗(yàn)46
• 4.3.4 Bt蛋白攝取量測(cè)定46
• 4.4 數(shù)據(jù)分析46
• 4.5 結(jié)果與分析46-55
• 4.5.1 Bt純蛋白試驗(yàn)結(jié)果46-51
• 4.5.2 Bt花粉試驗(yàn)51-55
• 4.6 討論55-57
• 第五章 Bt蛋白對(duì)意大利蜜蜂腸道微生物的影響57-76
• 5.1 材料方法57-58
• 5.1.1 供試?yán)ハx57
• 5.1.2 供試花粉57
• 5.1.3 供試試劑57
• 5.1.4 主要儀器57-58
• 5.2 試驗(yàn)內(nèi)容58-60
• 5.2.1 意大利蜜蜂的飼喂58
• 5.2.2 樣品DNA的提取及檢測(cè)58
• 5.2.3 PCR擴(kuò)增58-59
• 5.2.4 DGGE圖譜分析59-60
• 5.2.5 16S rRNA基因文庫(kù)與測(cè)序60
• 5.3 結(jié)果分析60-74
• 5.3.1 意大利蜜蜂幼蟲腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)60-64
• 5.3.1.1 DNA提取結(jié)果及PCR擴(kuò)增結(jié)果60-61
• 5.3.1.2 DGGE圖譜分析結(jié)果61-62
• 5.3.1.3 DGGE圖譜條帶克隆測(cè)序結(jié)果分析62-64
• 5.3.2 意大利蜜蜂成蟲中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)64-74
• 5.3.2.1 DNA提取結(jié)果及PCR擴(kuò)增結(jié)果64-66
• 5.3.2.2 DGGE圖譜分析結(jié)果66-68
• 5.3.2.3 DGGE圖譜條帶克隆測(cè)序結(jié)果分析68-74
• 5.5 討論74-76
• 第六章結(jié)論76-78
• 6.1 結(jié)論76-77
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)77
• 6.3 展望77-78
• 參考文獻(xiàn)78-88
• 致謝88-89
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷89-90

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1048420