本文關(guān)鍵詞：PeHSF激活PeWRKY1調(diào)控胡楊耐鹽機(jī)制研究

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【摘要】：在鹽脅迫條件下,胡楊(Populus euphratica)通過復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控胞內(nèi)離子平衡和活性氧平衡。微陣列分析結(jié)果表明,與鹽敏感的群眾楊相比,胡楊在NaCl脅迫下除了能上調(diào)部分離子平衡以及活性氧平衡相關(guān)基因,還能夠迅速誘導(dǎo)與逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子如WRKY、MYB、 HSF(熱激轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)。將胡楊逆境脅迫關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PeHSF和PeWRK Y1基因分別轉(zhuǎn)化到煙草中,對轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的表型進(jìn)行鑒定,并深入探討了胡楊PeHSF和PeWRKY1的相互關(guān)系及其在耐鹽性中的作用。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論如下：胡楊PeHSF對植物ROS平衡的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在胡楊葉片和愈傷細(xì)胞中,PeHSF的mRNA水平都呈現(xiàn)出了隨NaCl(150mM)脅迫時(shí)間的延長而呈現(xiàn)規(guī)律變化：在鹽處理后即被激發(fā),到達(dá)峰值,然后回落。而在DPI(質(zhì)膜NADPH抑制劑)和LaCl3(質(zhì)膜鈣通道抑制劑)存在下,mlRNA表達(dá)量卻受到抑制,表明PeHSF在鹽脅迫下受到H202和Ca2+信號(hào)激活。對轉(zhuǎn)基因煙草幼苗進(jìn)行鹽處理,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PeHSF基因可以提高煙草種子萌發(fā)率、促進(jìn)根系生長；隨后研究證明耐鹽性的提高歸結(jié)于抗氧化系統(tǒng)的增強(qiáng)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與野生型植株相比,轉(zhuǎn)基因株系體內(nèi)活性氧在鹽脅迫下能夠得到有效清除,而且轉(zhuǎn)基因株系中的APX、GR、GPX轉(zhuǎn)錄水平和酶活力與野生型相比,都得到了提高。胡楊PeWRKY1對植物離子平衡的調(diào)控作用。與野生型煙草相比,轉(zhuǎn)PeWRKY1基因煙草植株無論是種子存活率還是根系生長都顯示出對鹽脅迫更強(qiáng)的適應(yīng)性。離子流數(shù)據(jù)顯示：短期鹽脅迫處理(100mmol/L NaCl、24 h)后,轉(zhuǎn)基因型煙草Na+外流升高,鉀離子出現(xiàn)明顯的內(nèi)流。而野生型煙草Na+卻出現(xiàn)內(nèi)流、鉀離子外流立即升高,并在一定的水平保持一段的時(shí)間。PeHSF激活PeWRKY1調(diào)控胡楊耐鹽性的機(jī)制。通過對所克隆得到的胡楊PeWRKYl的全長基因序列進(jìn)行比對分析,發(fā)現(xiàn)胡楊PeWRKY1與灰楊PcWRKY1高度一致(95%)；通過genomic walking技術(shù)得到胡楊PeWRKYl和鹽敏感楊樹灰楊(Populus × canescens) PcWRKYl基因編碼區(qū)上游啟動(dòng)子序列。經(jīng)過序列比對,發(fā)現(xiàn)胡楊PeWRKY1轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū)域(PeWRKY1-pro)與鹽敏感的毛果楊、灰楊具有顯著差異。主要體現(xiàn)在：胡楊PeWRKY1啟動(dòng)子區(qū)含有多個(gè)熱激元件(HSEs)串聯(lián)重復(fù)、呈簇狀存在。酵母單雜交結(jié)果顯示,胡楊PeHSF可以和PeWR KY1啟動(dòng)子區(qū)的HSE元件相結(jié)合。為了驗(yàn)證HSE元件是否參與調(diào)節(jié)鹽脅迫下PeWRKY1的表達(dá),分別將PeWRKY1-pro::GUS 和 PcWRKY1-pro::=GUS共同轉(zhuǎn)化煙草,進(jìn)行鹽處理。GUS顯色結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)化PeWRKY1-pro::GUS的煙草中,根、莖、葉同時(shí)顯示出GUS高活性,而在PcWRKY1-pro::GUS中并不明顯。在鹽處理的胡楊中,利用煙草脆裂病毒(TRV)誘導(dǎo)eHSF沉默后,PewRKY1的表達(dá)量也隨之下降,從而證明在NaCl脅迫下PeWRKY1的表達(dá)受PeHSF的調(diào)控。綜上,胡楊熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子在鹽誘導(dǎo)的H2O2和胞質(zhì)Ca2+激發(fā)下,通過提高胡楊抗氧化酶活性,降低了體內(nèi)ROS水平以抵御鹽誘導(dǎo)的氧化傷害。另一方面,胡楊PeHSF在鹽脅迫下可以與PeWRKYl啟動(dòng)子區(qū)HSE元件相結(jié)合,調(diào)控PeWRKYl的表達(dá),調(diào)控離子平衡,進(jìn)而抵御鹽誘導(dǎo)的離子傷害。
【關(guān)鍵詞】：PeHSF PeWRKY1 PeWRKY1啟動(dòng)子 基因沉默 鹽脅迫
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S792.11
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 縮略詞(Abbreviation)12-13
• 引言13-15
• 1. 文獻(xiàn)綜述15-25
• 1.1 胡楊離子平衡和活性氧平衡的調(diào)控機(jī)制15-17
• 1.1.1 胡楊離子平衡調(diào)控機(jī)制15-17
• 1.1.2 胡楊活性氧平衡調(diào)控機(jī)制17
• 1.2 熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子及其研究進(jìn)展17-21
• 1.2.1 HSF的結(jié)構(gòu)特征18
• 1.2.2 植物HSF的多樣性18-20
• 1.2.3 植物HSF的相互作用20
• 1.2.4 植物HSF的特異性20-21
• 1.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子及其研究進(jìn)展21-24
• 1.3.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征21-22
• 1.3.2 WRKY家族成員調(diào)控植物生物脅迫及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)22
• 1.3.3 WRKY家族成員調(diào)控植物非生物脅迫及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)22-24
• 1.4 研究思路24-25
• 2. 胡楊熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子PeHSF調(diào)控活性氧平衡25-49
• 2.1 HSF的轉(zhuǎn)錄活性分析26-34
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)原理26
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 2.1.2.1 植物材料26
• 2.1.2.2 菌株、質(zhì)粒與試劑26-27
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法27-30
• 2.1.3.1 胡楊PeHSF基因的克隆及生物信息學(xué)分析27-28
• 2.1.3.2 胡楊PeHSF轉(zhuǎn)錄激活功能驗(yàn)證28-30
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-34
• 2.1.4.1 胡楊PeHSF蛋白序列分析30-33
• 2.1.4.2 胡楊PeHSF轉(zhuǎn)錄激活活性的驗(yàn)證33-34
• 2.2 PEHSF耐鹽性功能分析34-40
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料34
• 2.2.1.1 植物材料34
• 2.2.1.2 試劑34
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法34-35
• 2.2.2.1 胡楊PeHSF過表達(dá)煙草植株的鑒定34-35
• 2.2.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的T1代耐鹽性分析35
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-39
• 2.2.3.1 PeHSF轉(zhuǎn)基因煙草的PCR與RT-PCR鑒定35-36
• 2.2.3.2 PeHSF轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下的表型差異36-38
• 2.2.3.3 PeHSF轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下Na~+、K~+、Ca~(2+)濃度的變化38-39
• 2.2.4 小結(jié)39-40
• 2.3 鹽脅迫下PEHSF調(diào)控植物活性氧平衡40-44
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料40
• 2.3.1.1 植物材料40
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-41
• 2.3.2.1 抗氧化酶活力的測定40-41
• 2.3.2.2 抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平測定41
• 2.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-43
• 2.3.4 小結(jié)43-44
• 2.4 PEHSF響應(yīng)鹽脅迫的信號(hào)通路44-48
• 2.4.1 實(shí)驗(yàn)材料44
• 2.4.1.1 植物材料44
• 2.4.1.2 試劑44
• 2.4.2 實(shí)驗(yàn)方法44-45
• 2.4.2.1 RT-PCR檢測HSF表達(dá)模式44
• 2.4.2.2 檢測煙草植株的內(nèi)源H_2O_244-45
• 2.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-47
• 2.4.4 小結(jié)47-48
• 2.5 討論48-49
• 3. PeHSF激活PeWRKY1調(diào)控胡楊離子平衡49-95
• 3.1 PEWRKY1與PCWRKY1表達(dá)模式比較51-58
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料51
• 3.1.1.1 植物材料51
• 3.1.1.2 菌株、質(zhì)粒與試劑51
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 3.1.2.1 胡楊PeWRKY1灰楊PcWRKY1序列克隆及生物信息學(xué)分析51-52
• 3.1.2.2 胡楊PeWRKY1灰楊PcWRKY1表達(dá)模式分析52-53
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-58
• 3.1.3.1 PeWRKY1和PcWRKY1生物信息學(xué)分析53-56
• 3.1.3.2 PeWRKY1和PcWRKY1表達(dá)模式比較56-58
• 3.2 PEWRKY1耐鹽性功能分析58-65
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料58
• 3.2.1.1 植物材料58
• 3.2.1.2 菌株、質(zhì)粒與試劑58
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 3.2.2.1 轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下的表型58
• 3.2.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下生理指標(biāo)測定58-59
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-64
• 3.2.3.1 耐鹽性表型分析59-61
• 3.2.3.2 PeWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下的光合參數(shù)變化61
• 3.2.3.3 PeWRKY1轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下根尖K~+、Na~+離子流的變化61-64
• 3.2.4 討論64-65
• 3.3 PEWRKY1和PCWRKY1啟動(dòng)子分析65-72
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)材料65
• 3.3.1.1 植物材料65
• 3.3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與菌種65
• 3.3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器65
• 3.3.2 實(shí)驗(yàn)方法65-67
• 3.3.2.1 胡楊PeWRKY1和灰楊PcWRKY1啟動(dòng)子的克隆及生物信息學(xué)分析65
• 3.3.2.2 胡楊PeWRKY1和灰楊PcWRKY1啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建65-66
• 3.3.2.3 PeWRKY1和PcWRKY1啟動(dòng)子表達(dá)差異分析66-67
• 3.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-71
• 3.3.3.1 PeWRKY1和PcWRKY1啟動(dòng)子序列生物信息學(xué)分析67-69
• 3.3.3.2 PeWRKY1和PcWRKY1啟動(dòng)子表達(dá)差異性分析69-71
• 3.3.4 小結(jié)71-72
• 3.4 PEHSF和PEWRKY1亞細(xì)胞定位72-77
• 3.4.1 實(shí)驗(yàn)材料72
• 3.4.1.1 植物材料72
• 3.4.1.2 載體與菌株72
• 3.4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑72
• 3.4.2 實(shí)驗(yàn)方法72-75
• 3.4.2.1 定位載體的構(gòu)建72-73
• 3.4.2.2 基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞73-74
• 3.4.2.3 PEG轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體74-75
• 3.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果75-77
• 3.5 胡楊PEHSF與PEWRKY1啟動(dòng)子(PEWRKY1-PRO)HSE序列的相互作用77-95
• 3.5.1 酵母雜交77-84
• 3.5.1.1 實(shí)驗(yàn)原理77-78
• 3.5.1.2 實(shí)驗(yàn)材料78-79
• 3.5.1.3 實(shí)驗(yàn)方法79-80
• 3.5.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果80-83
• 3.5.1.5 小結(jié)83-84
• 3.5.2 TRV病毒誘導(dǎo)基因沉默84-95
• 3.5.2.1 病毒誘導(dǎo)基因沉默原理84-85
• 3.5.2.2 實(shí)驗(yàn)材料85-86
• 3.5.2.3 實(shí)驗(yàn)方法86-88
• 3.5.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果88-94
• 3.5.2.5 小結(jié)94-95
• 4. 結(jié)論95-97
• 5. 展望97-99
• 參考文獻(xiàn)99-111
• 個(gè)人簡介111-113
• 博士在讀期間成果清單113-115
• 導(dǎo)師簡介115-117
• 致謝11

【相似文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 申澤丹;PeHSF激活PeWRKY1調(diào)控胡楊耐鹽機(jī)制研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1047041