本文關(guān)鍵詞：粉紅螺旋聚孢霉67-1菌寄生相關(guān)基因的篩選與功能研究

  更多相關(guān)文章： 粉紅螺旋聚孢霉 核盤菌 菌寄生相關(guān)基因 過表達(dá) 基因敲除

【摘要】：粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea,又名粉紅粘帚霉Gliocladium roseum)是一類重要的菌寄生真菌,可以防治核盤菌、灰葡萄孢、鐮刀菌、立枯絲核菌等引起的多種植物真菌病害,同時還可以促進(jìn)作物生長,在溫室和田間試驗中廣泛應(yīng)用,具有巨大的生防潛力。但目前尚未見該菌寄生核盤菌菌核分子機制的報道。為闡明粉紅螺旋聚孢霉寄生菌核機制,篩選菌寄生相關(guān)基因,本研究以實驗室前期分離得到的一株高效粉紅螺旋聚孢霉菌株67-1為材料,通過高通量測序技術(shù)分別獲得了67-1全基因組序列和寄生核盤菌菌核轉(zhuǎn)錄組信息,并研究了其脂滴包被蛋白基因per3、幾丁質(zhì)酶基因chi67和單加氧酶基因mono67在寄生菌核過程中的作用。本研究以67-1菌絲為材料,提取基因組DNA后進(jìn)行全基因組測序和分析。首先構(gòu)建了三個PE文庫(170 bp,300 bp和500 bp)和1個MP文庫(5 kb),采用Illumina Hiseq 2500平臺進(jìn)行測序,測序覆蓋度大于150×,對序列進(jìn)行組裝后共得到1,552個contigs(重疊群),N50為99,664 bp。這些contigs繼續(xù)組裝形成475個scaffolds,N50為569,489 bp。最終組裝信息表明,67-1基因組大小為55.4 Mb,G+C含量為49.2%。通過Fgenesh軟件分析,共預(yù)測出20,747個基因,與NCBI NR數(shù)據(jù)庫比對,共有13,474個找到同源序列。67-1基因組序列信息為后續(xù)研究其與植物病原真菌的互作提供分子基礎(chǔ)。為研究粉紅螺旋聚孢霉67-1寄生核盤菌菌核分子機制并篩選寄生相關(guān)基因,本研究利用高通量測序和實時熒光定量PCR技術(shù)篩選獲得了67-1寄生核盤菌菌核不同時間間隔(8 h、24 h和48 h)的差異表達(dá)基因。轉(zhuǎn)錄組測序和分析表明共得到26,351個單值基因,其中有18,525個基因可以注釋到NR、KEGG、Swiss-Prot、GO和COG數(shù)據(jù)庫。在3個寄生時間段分別有3,217、4,025和4,274個基因上調(diào)表達(dá),2,739、1,249和1,064個基因下調(diào)表達(dá)。對差異表達(dá)基因進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)菌核誘導(dǎo)下12個基因明顯上調(diào)表達(dá),與轉(zhuǎn)錄組分析一致,為研究粉紅螺旋聚孢霉寄生相關(guān)基因提供候選基因。內(nèi)參基因是應(yīng)用實時熒光定量PCR精確檢測基因表達(dá)量的基礎(chǔ)。為了篩選67-1寄生菌核過程中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,本研究選擇了7個真菌常用的管家基因,18S核糖體蛋白基因(18S r RNA)肌動蛋白基因(Actin),β-微管蛋白基因(β-tubulin),延伸因子基因(Elongation factor),泛素基因(Ubiquitin),泛素結(jié)合蛋白基因(Ubiquitin-conjugating enzyme)和甘油3-磷酸脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),通過ge Norm、Bestkeeper和Normfinder三個常用內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析軟件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)延伸因子基因表達(dá)在不同階段均最為穩(wěn)定,可以用于67-1寄生核盤菌菌核相關(guān)基因的定量。本文通過67-1寄生菌核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,得到一個編碼脂滴包被蛋白的基因per3、一個幾丁質(zhì)酶基因chi67和一個單加氧酶基因mono67,這三個基因均在菌核誘導(dǎo)下顯著上調(diào)表達(dá)。通過全基因組信息獲得3個基因全長DNA序列。分別對per3和chi67過表達(dá),發(fā)現(xiàn)突變菌株對菌核的寄生能力顯著提高,16 h達(dá)到100%。防治大豆菌核病溫室盆栽試驗表明,per3轉(zhuǎn)化子6-4防治大豆菌核病效果最好,達(dá)到76.5%,比野生菌株和多菌靈分別高23.8%和20.9%。這是脂滴包被蛋白在菌寄生菌中首次作為生防因子的報道。chi67轉(zhuǎn)化子在16 h時對菌核寄生力比野生菌株高130%,對大豆菌核病防效分別比野生菌株和多菌靈高31.7%和28.7%,且產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力是野生菌株的2.4倍。對mono67基因進(jìn)行敲除驗證,利用同源重組原理構(gòu)建了mono67敲除載體,并成功獲得了敲除突變株Δmono67。室內(nèi)和溫室生測表明,Δmono67對核盤菌菌核的侵染起始時間與野生菌株基本一致,但寄生水平由野生菌株的四級降為三級,并且對盆栽大豆菌核病的防效明顯下降。相關(guān)研究為進(jìn)一步開發(fā)寄生相關(guān)基因提供基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：粉紅螺旋聚孢霉 核盤菌 菌寄生相關(guān)基因 過表達(dá) 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S476.1
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 英文縮略表15-16
• 第一章 引言16-32
• 1.1 植物真菌病害及防治16-17
• 1.1.1 植物真菌病害16
• 1.1.2 生物防治16-17
• 1.2 菌寄生過程相關(guān)基因研究進(jìn)展17-23
• 1.2.1 菌寄生真菌的種類17
• 1.2.2 菌寄生相關(guān)基因的研究手段17-18
• 1.2.3 菌寄生過程相關(guān)基因的研究進(jìn)展18-23
• 1.3 粘帚霉研究進(jìn)展23-26
• 1.3.1 生物學(xué)特性23-24
• 1.3.2 生物防治效果24
• 1.3.3 粘帚霉的生防機制24-25
• 1.3.4 粘帚霉生防基因的篩選與轉(zhuǎn)化25-26
• 1.4 高通量測序技術(shù)研究進(jìn)展26-29
• 1.4.1 高通量測序技術(shù)及發(fā)展26-28
• 1.4.2 高通量測序技術(shù)的應(yīng)用28-29
• 1.5 內(nèi)參基因的研究進(jìn)展29-31
• 1.5.1 內(nèi)參基因研究的必要性29
• 1.5.2 內(nèi)參基因滿足的條件29
• 1.5.3 常用的內(nèi)參基因29-30
• 1.5.4 內(nèi)參基因的篩選方法30-31
• 1.6 本研究的目的和意義31-32
• 第二章 粉紅螺旋聚孢霉 67-1 全基因組測序及分析32-44
• 2.1 材料與方法32-36
• 2.1.1 菌株和培養(yǎng)基32
• 2.1.2 67-1 菌絲收集32
• 2.1.3 67-1 DNA提取及質(zhì)量檢測32-33
• 2.1.4 67-1 菌種鑒定33-34
• 2.1.5 基因組文庫構(gòu)建及測序34
• 2.1.6 原始數(shù)據(jù)處理34-35
• 2.1.7 全基因組數(shù)據(jù)組裝35
• 2.1.8 全基因組基因注釋35
• 2.1.9 非編碼RNA(nc RNA)預(yù)測35
• 2.1.10 67-1 基因家族分析35-36
• 2.2 實驗結(jié)果36-42
• 2.2.1 樣品DNA提取及質(zhì)量檢測36
• 2.2.2 全基因組測序及組裝36-39
• 2.2.3 基因注釋及分析39-42
• 2.2.4 非編碼RNA預(yù)測42
• 2.2.5 67-1 基因家族分析42
• 2.3 討論42-44
• 第三章 粉紅螺旋聚孢霉 67-1 寄生核盤菌菌核轉(zhuǎn)錄組測序及分析44-65
• 3.1 材料與方法44-51
• 3.1.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件44
• 3.1.2 樣品處理44-45
• 3.1.3 RNA提取45-47
• 3.1.4 c DNA文庫構(gòu)建及測序47
• 3.1.5 數(shù)據(jù)處理47
• 3.1.6 轉(zhuǎn)錄組序列組裝47
• 3.1.7 轉(zhuǎn)錄組Unigene功能注釋及分析47-48
• 3.1.8 Unigene表達(dá)差異分析48-49
• 3.1.9 Unigene SSR分析49
• 3.1.10 Unigene SNP分析49
• 3.1.11轉(zhuǎn)錄組實時熒光定量PCR驗證49-51
• 3.2 實驗結(jié)果51-63
• 3.2.1 樣品RNA提取及質(zhì)量檢測51-52
• 3.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及組裝52-54
• 3.2.3 Unigene功能注釋及分析54-58
• 3.2.4 寄生過程差異表達(dá)基因的的篩選58-61
• 3.2.5 Unigene SSR分析61
• 3.2.6 Unigene SNP分析61-62
• 3.2.7 實時熒光定量PCR驗證62-63
• 3.3 討論63-65
• 第四章 粉紅螺旋聚孢霉 67-1 寄生核盤菌菌核內(nèi)參基因篩選65-71
• 4.1 材料與方法65-67
• 4.1.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件65
• 4.1.2 菌核誘導(dǎo)處理65
• 4.1.3 RNA提取和c DNA第一鏈合成65
• 4.1.4 內(nèi)參基因的擴增65-66
• 4.1.5 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性研究66
• 4.1.6 絲氨酸蛋白酶基因的表達(dá)分析66-67
• 4.2 實驗結(jié)果67-70
• 4.2.1 內(nèi)參基因引物特異性擴增67
• 4.2.2 內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析67-68
• 4.2.3 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析68-69
• 4.2.4 絲氨酸蛋白酶基因sep表達(dá)水平分析69-70
• 4.3 討論70-71
• 第五章 粉紅螺旋聚孢霉 67-1 轉(zhuǎn)脂滴包被蛋白基因功能研究71-84
• 5.1 材料與方法71-76
• 5.1.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件71
• 5.1.2 菌核誘導(dǎo)下粉紅螺旋聚孢霉 67-1 per3表達(dá)量檢測71-72
• 5.1.3 per3全長克隆72
• 5.1.4 per3生物信息學(xué)分析72-73
• 5.1.5 per3過表達(dá)載體構(gòu)建73-74
• 5.1.6 per3過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化74-75
• 5.1.7 轉(zhuǎn)化子的篩選及生物學(xué)特性75
• 5.1.8 轉(zhuǎn)化子對大豆核盤菌菌核寄生性測定75
• 5.1.9 轉(zhuǎn)化子盆栽防治大豆菌核病試驗75-76
• 5.1.10 轉(zhuǎn)化子per3表達(dá)量測定76
• 5.1.11 統(tǒng)計分析76
• 5.2 實驗結(jié)果76-83
• 5.2.1 菌核誘導(dǎo)下粉紅螺旋聚孢霉 67-1 per3表達(dá)水平76-77
• 5.2.2 per3基因克隆與特性77-78
• 5.2.3 p AN71per3載體構(gòu)建78
• 5.2.4 per3轉(zhuǎn)化子的篩選和生物學(xué)性狀78-79
• 5.2.5 轉(zhuǎn)化子對大豆核盤菌菌核寄生性測定79-81
• 5.2.6 轉(zhuǎn)化子per3表達(dá)量測定81
• 5.2.7 轉(zhuǎn)化子盆栽防治大豆菌核病試驗81-83
• 5.3 討論83-84
• 第六章 粉紅螺旋聚孢霉 67-1 轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶高效工程菌株的構(gòu)建84-96
• 6.1 材料與方法84-87
• 6.1.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件84
• 6.1.2 菌核誘導(dǎo)下粉紅螺旋聚孢霉 67-1 chi67表達(dá)量檢測84
• 6.1.3 chi67全長克隆84-85
• 6.1.4 chi67生物信息學(xué)分析85
• 6.1.5 chi67過表達(dá)載體的構(gòu)建85-86
• 6.1.6 chi67過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化86
• 6.1.7 轉(zhuǎn)化子的篩選及生物學(xué)特性86
• 6.1.8 轉(zhuǎn)化子對大豆核盤菌菌核寄生性測定86-87
• 6.1.9 轉(zhuǎn)化子幾丁質(zhì)酶活性測定87
• 6.1.10轉(zhuǎn)化子chi67表達(dá)量測定87
• 6.1.11轉(zhuǎn)化子盆栽防治大豆菌核病試驗87
• 6.1.12統(tǒng)計分析87
• 6.2 實驗結(jié)果87-95
• 6.2.1 菌核誘導(dǎo)下粉紅螺旋聚孢霉 67-1 chi67表達(dá)水平87-88
• 6.2.2 chi67基因克隆與特性88-89
• 6.2.3 p AN71chi67轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建89-90
• 6.2.4 chi67轉(zhuǎn)化子的篩選和生物學(xué)研究90-91
• 6.2.5 轉(zhuǎn)化子對大豆核盤菌菌核寄生性測定91-92
• 6.2.6 轉(zhuǎn)化子幾丁質(zhì)酶活測定92-93
• 6.2.7 轉(zhuǎn)化子chi67表達(dá)量測定93
• 6.2.8 轉(zhuǎn)化子盆栽防治大豆菌核病試驗93-95
• 6.3 討論95-96
• 第七章 粉紅螺旋聚孢霉 67-1 單加氧酶基因功能研究96-105
• 7.1 材料與方法96-99
• 7.1.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件96
• 7.1.2 菌核誘導(dǎo)下粉紅螺旋聚孢霉 67-1 mono67表達(dá)量檢測96-97
• 7.1.3 mono67全長克隆97
• 7.1.4 mono67生物信息學(xué)分析97
• 7.1.5 mono67敲除載體的構(gòu)建97-98
• 7.1.6 mono67敲除載體的轉(zhuǎn)化98-99
• 7.1.7 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選與驗證99
• 7.1.8 轉(zhuǎn)化子對大豆核盤菌菌核寄生性測定99
• 7.1.9 轉(zhuǎn)化子盆栽防治大豆菌核病試驗99
• 7.1.10 統(tǒng)計分析99
• 7.2 實驗結(jié)果99-103
• 7.2.1 菌核誘導(dǎo)下粉紅螺旋聚孢霉 67-1 mono67表達(dá)水平99-100
• 7.2.2 mono67基因克隆與特性100
• 7.2.3 pUC19-mono67敲除載體的構(gòu)建100-101
• 7.2.4 轉(zhuǎn)化子的篩選101
• 7.2.5 轉(zhuǎn)化子對大豆核盤菌菌核寄生性測定101-102
• 7.2.6 轉(zhuǎn)化子盆栽防治大豆菌核病試驗102-103
• 7.3 討論103-105
• 第八章 全文結(jié)論105-106
• 參考文獻(xiàn)106-120
• 致謝120-121
• 作者簡歷121

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1042176