本文關鍵詞：大菱鲆性別決定機制與染色體組工程育種技術的研究

  更多相關文章： 大菱鲆 真鯛精子 性別決定 染色體組操作 雌核發(fā)育 四倍體

【摘要】：大菱鲆(Scophthalmus maximus)是世界性鲆鰈類養(yǎng)殖良種,養(yǎng)殖范圍遍及歐、美、亞洲十幾個沿海國家。中國是大菱鲆養(yǎng)殖大國,年產量近6萬噸,占世界養(yǎng)殖總產量的80%以上,產業(yè)年產值超過50億元,是北方海水養(yǎng)殖支柱產業(yè),可以說,涉及大菱鲆苗種養(yǎng)殖性狀的微小提升都將對產業(yè)發(fā)展起到級聯(lián)促進作用。染色體組工程育種技術是魚類遺傳育種和種質改良的重要組成部分,也是研究魚類性別遺傳決定類型的最直接和有效的方法。本研究建立了大菱鲆減數分裂型、有絲分裂型雌核發(fā)育和四倍體誘導等染色體組操作技術,明確了大菱鲆性腺分化關鍵時期及其性別遺傳決定機制,為大菱鲆全雌和三倍體苗種產業(yè)化培育奠定了基礎。主要研究結果如下：(1)大菱鲆減數分裂型雌核發(fā)育二倍體的誘導采用正交設計實驗方法優(yōu)化了真鯛冷凍精子誘導大菱鲆減數分裂型雌核發(fā)育的誘導條件。結果表明,真鯛精子是誘導大菱鲆卵子胚胎發(fā)育的理想刺激源,未經紫外線照射處理的真鯛精子與大菱鲆卵子受精后形成的胚胎,無論是否經過冷休克處理都不能孵化出膜；精液稀釋至1/20、厚度0.4mm,經劑量為6480-7200 erg·mm-2紫外線照射處理后的真鯛精子與大菱鲆卵子受精后形成的胚胎,初孵仔魚表現出典型的單倍體綜合征；受精和孵化水溫為(14.5±0.5℃)時,大菱鲆減數分裂型雌核發(fā)育單倍體的冷休克二倍體化的最佳處理起始時間、處理水溫和持續(xù)時間分別為受精后6.5 min、-2℃和45 min。至孵化后60口齡,雌核發(fā)育苗種的成活率為0.61%,僅相當于其半同胞苗種的10%左右,60-180日齡兩者成活率的差異不顯著,均達90%以上；14月齡前,雌核發(fā)育苗種的全長和體重都比半同胞普通苗種要低,至17月齡時其全長和體重與半同胞對照一致,兩者無顯著性差異。(2)大菱鲆不同倍性胚胎發(fā)育時序和形態(tài)的比較研究對真鯛冷凍精液誘導的大菱鲆單倍體、減數分裂型雌核發(fā)育二倍體和雜交二倍體,以及同源精子誘導的大菱鲆三倍體和普通二倍體胚胎發(fā)育時序和形態(tài)進行了比較研究。結果表明,在水溫14.5±0.5℃孵化條件下,三倍體和雌核發(fā)育二倍體胚胎發(fā)育速度一直較普通二倍體為慢,三倍體稍快于雌核發(fā)育二倍體；單倍體在囊胚期前胚胎發(fā)育速度最快,囊胚期后發(fā)育速度逐漸變慢,原腸期發(fā)育時間最長；雜交二倍體在尾芽期前胚胎發(fā)育速度一直比普通二倍體快,心跳期胚胎發(fā)育開始停止,胚胎死亡,不能正常孵出；除雜交二倍體外的各實驗組至孵化出膜所需時間和孵化率分別為：普通二倍體109hl5min和83.4±3.02%,三倍體109h30min和44.6±2.40%,雌核發(fā)育二倍體112hl5min和42.4±3.54%,單倍體124h40min和4.5±1.91%。各組胚胎發(fā)育形態(tài)上的差別主要表現為雜交二倍體胚體細長,多數器官分化不全；單倍體胚胎胚體粗短、頭突大、脊柱彎曲明顯,表現出典型的單倍體綜合癥；雌核發(fā)育二倍體、三倍體與普通二倍體胚胎相比,形態(tài)上沒有明顯差別,但初孵仔魚畸形率顯著增高。(3)大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育二倍體的誘導采用靜水壓法抑制第一次卵裂,對紫外線滅活的真鯛冷凍精子誘導大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育的實驗條件進行了研究。結果表明,在受精和孵化水溫為14.5±0.5℃時,靜水壓法誘導大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育二倍體的最佳處理起始時間、處理壓力和持續(xù)時間分別為受精后85-90 min、75 MPa和6 min。同一批次受精卵有絲分裂型雌核發(fā)育孵化率顯著低于減數分裂型雌核發(fā)育,胚胎畸形率顯著高于后者。規(guī)模化誘導的有絲分裂型雌核發(fā)育孵化率為1.34%,至40dph成活率為3.25%,40-60 dph成活率為51.08%,均顯著低于同期普通二倍體,60-150dph成活率為98.95%,與普通二倍體差異不顯著；150 dph時,雌核發(fā)育二倍體體重(16.18±11.30 g)和全長(9.18±2.03 cm)均顯著低于普通二倍體(33.02±6.23 g和12.24±0.77 cm)；30尾雌核發(fā)育苗種在檢測的7個微衛(wèi)星位點基因純合度為99.52%。(4)大菱鲆同源四倍體的誘導采用靜水壓法抑制第一次卵裂,對大菱鲆同源四倍體誘導條件進行了研究。結果表明,在受精和孵化水溫為14.5±0.5℃時,大菱鲆四倍體誘導的最佳起始時間和處理壓力分別為75-80 min和75 MPa。利用獲得的最佳誘導條件處理獲得了2批次四倍體群體,四倍體誘導組孵化率(16.54%和11.40%)顯著低于對照組(71.62%),畸形率(45.79%和64.10%)則顯著高于對照組(4.54%),60 dph前成活率(0.43%和0.16%)顯著低于對照組(18.95%),60-365 dph成活率(95.48%)則與對照組(95.43%)相當,NORs-Ag染法、染色體核型分析和血紅細胞體積測量法分別統(tǒng)計初孵仔魚期、150 dph和365 dph苗種四倍體率分別為46.67%、5%和4.95%。(5)溫度對大菱鲆性別分化的影響及其性別遺傳決定類型通過組織切片觀察性腺分化情況、統(tǒng)計分析高溫誘導性腺分化期稚魚以及雌核發(fā)育稚魚的性別比例,研究大菱鲆性腺分化起始時期、溫度對早期性別決定的影響和性別遺傳決定機制。結果表明,稚魚最小全長37.43 mm(45 dph)時,形成完整卵巢腔,標志著卵巢分化的起始；全長42.83 mm(55 dph)時,形成輸精管,標志著精巢分化的起始。平均全長為12.30±1.45 mm(20 dph)20.05±1.24 mm(28 dph)稚魚,經25℃高溫培育和誘導,雄性比例分別為73.43±3.88%、74.40±6.36%,顯著偏離1：1的性比,高溫對初始平均全長30 mm(40dph)的稚魚的性別分化無影響,性別比例未偏離1：1�；谝�(guī)�；坪税l(fā)育誘導稚魚、減數分裂型子代成熟雄魚與普通雌魚受精子代苗種性別比例,明確大菱鲆性別遺傳決定類型為雌性異配型(ZW♀/ZZ♂)。
【關鍵詞】：大菱鲆 真鯛精子 性別決定 染色體組操作 雌核發(fā)育 四倍體
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-16
• 第一章 文獻綜述16-43
• 第一節(jié) 海水魚類染色體組工程育種技術研究概述16-34
• 1. 海水魚類雌核發(fā)育人工誘導技術研究進展16-30
• 1.1 魚類雌核發(fā)育誘導原理16-17
• 1.2 海水魚類雌核發(fā)育人工誘導技術17-26
• 1.3 海水魚類雌核發(fā)育與性別遺傳決定類型的鑒定26-30
• 2. 海水魚類多倍體誘導技術研究進展30-34
• 2.1 魚類多倍體誘導原理和方法30-31
• 2.2 魚類多倍體倍性鑒定方法及應用31-32
• 2.3 海水魚類多倍體育種研究進展及其應用前景32-34
• 第二節(jié) 鲆鰈類性別決定機制及性別分化研究進展34-40
• 1. 鲆鰈類性別決定機制35-38
• 1.1 鲆鰈類性別的遺傳決定機制35-36
• 1.2 溫度對鲆鰈類性別決定的影響36
• 1.3 自然種群分布緯度變化對鲆鰈類性別決定的影響36-37
• 1.4 生長速度對鲆鰈類性別決定的影響37-38
• 2. 鲆鰈類性別決定機制研究展望38-40
• 第三節(jié) 大菱鲆性別決定機制及染色體組操作技術研究進展40-43
• 第二章 大菱鲆減數分裂型雌核發(fā)育二倍體的誘導43-57
• 1 材料和方法44-46
• 1.1 大菱鲆卵和真鯛冷凍精子的來源44
• 1.2 受精卵孵化、胚胎發(fā)育觀察及受精率、孵化率的統(tǒng)計44
• 1.3 真鯛冷凍精子遺傳物質失活處理的Hertwig效應試驗44-45
• 1.4 大菱鲆減數分裂雌核發(fā)育冷休克誘導條件優(yōu)化45
• 1.5 大菱鲆減數分裂雌核發(fā)育誘導效果及倍性檢驗45
• 1.6 大菱鲆雌核發(fā)育苗種的培育及養(yǎng)殖45-46
• 1.7 數據處理46
• 2 結果46-53
• 2.1 真鯛冷凍精子遺傳物質失活處理的Hertwig效應46-47
• 2.2 大菱鲆減數分裂雌核發(fā)育冷休克誘導條件的優(yōu)化47-48
• 2.3 真鯛冷凍精子誘導大菱鲆減數分裂雌核發(fā)育的效果48-51
• 2.4 大菱鲆減數分裂型雌核發(fā)育苗種的培育及養(yǎng)殖51-53
• 3. 討論53-57
• 第三章 大菱鲆不同倍性胚胎發(fā)育時序和形態(tài)的比較57-70
• 1 材料和方法57-59
• 1.1 大菱鲆卵和真鯛冷凍精子的來源57
• 1.2 真鯛冷凍精液滅活處理57-58
• 1.3 試驗胚胎的獲得58
• 1.4 試驗胚胎發(fā)育觀察58
• 1.5 試驗胚胎倍性鑒定58-59
• 2 結果59-67
• 2.1 各試驗組受精率、孵化率和初孵仔魚畸形率59-60
• 2.2 各試驗組大菱鲆的胚胎發(fā)育過程60-66
• 2.3 初孵仔魚倍性鑒定66-67
• 3 討論67-70
• 第四章 大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育二倍體的誘導70-87
• 1 材料和方法71-74
• 1.1 大菱鲆卵和真鯛冷凍精子的來源71
• 1.2 真鯛冷凍精子遺傳物質滅活的紫外線照射處理方法71
• 1.3 人工受精、受精卵孵化、胚胎發(fā)育觀察方法71-72
• 1.4 大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育靜水壓誘導條件的建立72
• 1.5 有絲分裂型雌核發(fā)育誘導條件的驗證及其與減數分裂型雌核發(fā)育的比較72-73
• 1.6 大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育苗種的培育及養(yǎng)殖73-74
• 1.7 數據處理74
• 2 結果74-83
• 2.1 靜水壓法誘導大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育的實驗參數74-77
• 2.2 大菱鲆有絲分裂型和減數分裂型雌核發(fā)育誘導的比較研究77-80
• 2.3 大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育的規(guī)�；T導80-83
• 3 討論83-87
• 第五章 大菱鲆同源四倍體的誘導87-100
• 1 材料和方法88-91
• 1.1 大菱鲆精、卵采集88
• 1.2 受精卵孵化、胚胎發(fā)育觀察及受精率、孵化率的統(tǒng)計88-89
• 1.3 大菱鲆四倍體靜水壓法誘導條件的建立及仔魚倍性鑒定89-90
• 1.4 大菱鲆四倍體苗種的規(guī)�；T導及培育90-91
• 1.5 數據處理91
• 2 結果91-96
• 2.1 靜水壓法誘導大菱鲆四倍體的實驗參數91-93
• 2.2 大菱鲆四倍體的規(guī)�；T導93-96
• 3 討論96-100
• 第六章 溫度對大菱鲆性別分化的影響及其性別遺傳決定類型100-115
• 1 材料和方法101-104
• 1.1 大菱鲆性腺分化的組織學研究101-102
• 1.2 溫度對大菱鲆性別分化的影響102-104
• 1.3 大菱鲆雌核發(fā)育子代苗種的性別比例104
• 1.4 數據分析104
• 2 結果104-111
• 2.1 大菱鲆性腺分化的組織學和細胞學結果104-107
• 2.2 溫度對大菱鲆性別分化的影響107-110
• 2.3 大菱鲆雌核發(fā)育子代苗種的性別比例110-111
• 3 討論111-115
• 結果115-116
• 參考文獻116-138
• 致謝138-139
• 個人簡歷139
• 發(fā)表的學術論文139-140

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