本文關(guān)鍵詞：同源Hsp20和異源IL-10基因在蛋白質(zhì)Sec-分泌體系修飾的長雙歧桿菌NCC2705中的表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 長雙歧桿菌 功能蛋白表達(dá) 蛋白質(zhì)投遞 Sec-分泌系統(tǒng) 遺傳修飾

【摘要】：雙歧桿菌自1906年Henry Tissier發(fā)現(xiàn)以來,已成為一類重要的益生菌,益生功能的研究也不斷深入。根據(jù)雙歧桿菌的安全性和其經(jīng)消化道生存、定殖和生物被膜生成的能力,成為一種優(yōu)良的口服和腸道活菌調(diào)節(jié)菌。利用雙歧桿菌的益生和生物特性,具備作為安全的口服活體功能蛋白腸道投遞類的基因工程疫苗載體宿主的潛在特質(zhì)與基本條件。為了研究雙歧桿菌作為內(nèi)、外源功能蛋白表達(dá)和腸道定殖投遞載體體系的可行性,本研究選取長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) NCC2705菌株作為基因工程疫苗投遞模式載體,從同源基因表達(dá)、異源基因分泌表達(dá)及對分泌表達(dá)體系修飾進(jìn)而影響所表達(dá)和投遞目標(biāo)蛋白的分泌的影響幾個方面對其投遞載體功能進(jìn)行探索和評價。 同源基因nHsp的超表達(dá) 長雙歧桿菌遺傳轉(zhuǎn)化和篩選困難體系是限制其研究和應(yīng)用的瓶頸。本體系首先以同源基因超表達(dá)技術(shù)構(gòu)建用以建立長雙歧桿菌的轉(zhuǎn)化與篩選體系,以及對目標(biāo)蛋白的超量表達(dá)可能產(chǎn)生的細(xì)胞生理等功能的影響,判定轉(zhuǎn)化體系與目標(biāo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象及其產(chǎn)生功能進(jìn)行評價。研究通過構(gòu)建了具有大腸桿菌-長雙歧桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒,該質(zhì)粒的蛋白質(zhì)表達(dá)盒有Pgap啟動子和Thup終止子構(gòu)成,表達(dá)質(zhì)粒命名為pDP401。sHsp基因所編碼的蛋白是參與雙歧桿菌脅迫應(yīng)答機(jī)制的小熱激蛋家族因子�？寺〔Hsp基因插入pDP401表達(dá)盒中形成pDP401-sHsp載體,并通過優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化到長雙歧桿菌NCC2705中,得到的重組的長雙歧NCC2705轉(zhuǎn)化菌株o sHsp轉(zhuǎn)化菌株在各種非生物脅迫(熱脅迫、高溫脅迫、酸脅迫、膽鹽脅迫等)條件下的細(xì)胞生長活力、細(xì)胞密度及產(chǎn)酸能力與野生型NCC2705對照菌株相比均有顯著性提高,表明JHsp基因的超表達(dá)能夠使長雙歧桿菌NCC2705有效地抵御脅迫。以上結(jié)果表明,我們構(gòu)建了功能性的穿梭型長雙歧桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒,建立了有效的電轉(zhuǎn)化體系和成功的篩選技術(shù),向難于轉(zhuǎn)化的長雙歧桿菌中導(dǎo)入了抗性標(biāo)記的具有蛋白質(zhì)表達(dá)盒結(jié)構(gòu)的穿梭質(zhì)粒,其啟動子表達(dá)盒能有效地啟動目標(biāo)基因蛋白的轉(zhuǎn)錄和完成目標(biāo)蛋白的合成表達(dá),并產(chǎn)生有正確功能的蛋白。 異源基因編碼蛋白的表達(dá) 利用上述研究構(gòu)建的雙歧桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)穿梭質(zhì)粒骨架,我們構(gòu)建了人-白介素(IL-10)基因的異源表達(dá)載體pDP870-IL10,并成功實(shí)現(xiàn)在NCC2705轉(zhuǎn)化株中的表達(dá)。表明長雙歧桿菌對外源基因密碼子使用偏好性的差異具有一定的兼容性,其作為蛋白質(zhì)表達(dá)宿主菌具有一定的密碼子偏好性冗余度,能對未進(jìn)行密碼子優(yōu)化的人-白介素基因適度表達(dá)。這表明長雙歧桿菌NCC2705可以作為一種外源目標(biāo)蛋白的表達(dá)工程菌菌株。長雙歧桿菌NCC22705蛋白質(zhì)See-分泌體系的異源SecDF表達(dá)修飾 SecD/F是許多細(xì)菌蛋白質(zhì)Sec-分泌體系的重要構(gòu)成組分。但在許多乳酸菌和雙歧桿菌屬基因組中,缺少secDF基因編碼。Streptomyces coelicoler中的具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌功能,其Sec-體系的secDF蛋白為融蛋白由secDF編碼。本研究通克隆了S. coelicoler的secDF基因,構(gòu)建成長雙歧桿菌異源蛋白表達(dá)質(zhì)粒pDP870-secDF,并轉(zhuǎn)化到長雙歧桿菌NCC2705中,實(shí)現(xiàn)異源SecDF的表達(dá)。通過sqRT-PCR的方法檢測并驗(yàn)證了secDF基因在長雙歧桿菌NCC2705轉(zhuǎn)化株中的表達(dá)。本研究也是首次在雙歧桿菌中實(shí)現(xiàn)通過Sec-分泌系統(tǒng)的異源蛋白組分的表達(dá)轉(zhuǎn)化。 長雙歧分泌表達(dá)系統(tǒng)修飾對異源表達(dá)IL-10的分泌與功能實(shí)現(xiàn) 為驗(yàn)證Sec分泌系統(tǒng)對異源蛋白表達(dá)后蛋白質(zhì)分泌的影響,本論文對轉(zhuǎn)化后的菌株含有secDF基因及不含secDF基因的人IL-10表達(dá)質(zhì)粒陽性菌株菌體細(xì)胞孵育液/培養(yǎng)基總蛋白質(zhì)進(jìn)行了蛋白質(zhì)免疫雜交印跡(Western blot)檢測。結(jié)果顯示,存在分泌系統(tǒng)修飾組分secDF的長雙歧桿菌NCC2705與不存在分泌系統(tǒng)的長雙歧桿菌NCC2705表達(dá)的人IL-10含量存在一定的差異。長雙歧分泌的IL-10的生物功能通過IL-10對人HT-29細(xì)胞株腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制得到驗(yàn)證,表明長雙歧桿菌對外源蛋白表達(dá)后的分泌能通過對雙歧桿菌分泌體系修飾進(jìn)行工程化定向塑造。蛋白質(zhì)Sec-分泌系統(tǒng)的改造,對以益生菌為腸道活體疫苗投遞宿主的應(yīng)用具有一定的前景。
【關(guān)鍵詞】：長雙歧桿菌 功能蛋白表達(dá) 蛋白質(zhì)投遞 Sec-分泌系統(tǒng) 遺傳修飾
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• ABSTRACT5-8
• 摘要8-15
• LIST OF FIGURES15-17
• LIST OF TABLES17-18
• Abbrivations18-19
• Chapter Ⅰ: Introduction19-50
• 1.1 Bifidobacteria19-20
• 1.2 Gene expression in Bifidobacteria20-29
• 1.3 Functional assay of probiotic organisms29-34
• 1.4 Protein secretion in lactic acid bacteria/bifidobacteria34-44
• 1.4.1 Sec system37-38
• 1.4.2 Components of sec system38-44
• 1.5 Signal peptides44-46
• 1.6 Vaccine delivery46
• 1.7 IL-10 gene46-48
• 1.8 The aim of this study48-49
• 1.9 The general research technique route49-50
• Chapter Ⅱ: Homologous sHsp expression in bifidobacterium longum NCC270550-75
• 2.1 Introduction50-52
• 2.2 Materials and Methods52-63
• 2.2.1. Bacterial strains,plasmids,and culture conditions52
• 2.2.2 Media preparation52-53
• 2.2.3 Antibiotics53
• 2.2.4 IPTG and X-gal solution53
• 2.2.5 TAE agarose gel electrophoresis reagents53-55
• 2.2.6 Reagents for DNA extraction55-57
• 2.2.7 DNA extraction of B.longum NCC270557-58
• 2.2.8 TAE Agarose Gel Electrophoresis analysis58
• 2.2.9 Cloning of hsp20(BL0576)from B.longum strain NCC270558
• 2.2.10 Recycling/Purification of PCR products58
• 2.2.11 TA cloning PCR products of homologous shp 20 gene58-59
• 2.2.12 Transformation of PCR products into E.coli DH5α59
• 2.2.13 Preparation of Plasmid DNA and quantification of DNA59
• 2.2.14 Digestion of DNA59
• 2.2.15 Gel purification/Recycling of Digest DNA59-60
• 2.2.16 Ligation reaction60
• 2.2.17 Construction of expression vector and transformation60
• 2.2.18 Assay of stress tolerance of hsp20-overproducing B.longum NCC270560-61
• 2.2.19 Quantitative reverse transcription PCR(qRT-PCR)61-62
• 2.2.20 Statistical Analysis62-63
• 2.3 Results63-71
• 2.3.1 Cloning of homologous hsp 20(sHsp)gene and construction of homologous expression cassette63
• 2.3.2 Overexpression of hsp20(sHsp)in B.longum NCC270563-65
• 2.3.3 Heat-stress tolerance of sHsp-overproducing B.longum NCC270565-67
• 2.3.4 Salt-stress tolerance of sHsp-overproducing B.longum NCC270567-68
• 2.3.5 Multiple stress tolerance of hsp20-overexpressing B.longum NCC270568-71
• 2.4 Discussion71-74
• 2.5 Summary74-75
• Chapter Ⅲ: Heterologous IL-10 transformation in Bifidobacterium longum NCC270575-89
• 3.1 Introduction75-77
• 3.2 Materials and Methods77-82
• 3.2.1 Bacterial strains,plasmids,and culture conditions77
• 3.2.2 Media preparation77-78
• 3.2.3 Antibiotics78
• 3.2.4 IPTG and X-gal78-79
• 3.2.5 TAE agarose gel electrophoresis reagents79
• 3.2.6 Reagents for DNA extraction79
• 3.2.7 DNA extraction of B.longum NCC270579
• 3.2.8 Cloning of expression cassette(PGAP-IL10-Thup)from pESH9379
• 3.2.9 TAE agarose Gel Electrophoresis analysis79
• 3.2.10 Recycling/Purification of PCR products79-80
• 3.2.11 TA cloning of IL-10 gene80
• 3.2.12 Transformation of heterologous IL-10 into E.coli DH5α80
• 3.2.13 Plasmid DNA isolation and Quantification of DNA80
• 3.2.14 Digestion of DNA80
• 3.2.15 Gel purification/Recycling of Digest DNA80
• 3.2.16 Ligation reaction80
• 3.2.17 Heterologous IL-10 expression vector construction and transformation in B.longum NCC80-81
• 3.2.18 RNA isolation and sqRT-PCR81-82
• 3.3 Results82-87
• 3.3.1 pDP870-IL-10 expression vector82-84
• 3.3.2 Transformation of expression vectors in B.longum NCC270584
• 3.3.3 Semi-quantitative reverse transcription of IL-10 gene84-87
• 3.4 Discussion87-88
• 3.5 Summary88-89
• Chapter Ⅳ: Modification of Sec-system of Bifidobacterium longum NCC270589-109
• 4.1 Introduction89-91
• 4.2. Materials and Methods91-98
• 4.2.1 Bacterial strains,plasmids,and culture conditions91-93
• 4.2.2 Media preparation93
• 4.2.3 Antibiotics93-94
• 4.2.4 IPTG and X-gal94
• 4.2.5 TAE agarose gel electrophoresis reagents94
• 4.2.6 Reagents for DNA extraction94
• 4.2.7 DNA extraction of B.longum NCC270594
• 4.2.8 TAE agarose Gel Electrophoresis analysis94
• 4.2.9 Cloning of heterologous secDF and construction of expression vector94-95
• 4.2.10 Recycling/Purification of PCR products95
• 4.2.11 TA cloning of heterologous secDF95
• 4.2.12 Transformation of heterologous sec DF into E.coli DH5α95
• 4.2.13 Plasmid DNA isolation and Quantification of DNA95
• 4.2.14 Digestion of DNA95-96
• 4.2.15 Gel purification/Recycling of Digest DNA96
• 4.2.16 Ligation reaction96
• 4.2.17 Modification of sec system in B.longum NCC270596
• 4.2.18 RNA isolation and sqRT-PCR96-98
• 4.3 Results98-105
• 4.3.1 pDP870-SecDF expression vector98-100
• 4.3.2 pDP870-SecDF-IL10 expression vector100-101
• 4.3.3 Transformation of expression vectors and modification of sec machinery in Bifidobacterium longum NCC2705101-103
• 4.3.4 RNA isolation and semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction103-105
• 4.4 Discussion105-107
• 4.5 Summary107-109
• Chapter Ⅴ: Protein expression and function assay in sec-System modified Bifidobacterium longum NCC2705109-125
• 5.1 Introduction109-111
• 5.2 Material and methods111-117
• 5.2.1 Strains, reagents and solutions111-112
• 5.2.2 Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis112-113
• 5.2.3 Preparation of bacterial cell fractions113
• 5.2.4 TCA precipitation of supernatant protein113-114
• 5.2.5 Coomassie staining114
• 5.2.6 Western blotting114
• 5.2.7 Binding of transferred protein with specific antibodies114-115
• 5.2.8 Culture condition and epithelial HT-29 cell line application on sec modified Bifidobacterial strains115-117
• 5.3 Results117-122
• 5.3.1 Protein secretion of B. longum NCC2705117-118
• 5.3.2 Western blot analysis for IL-10 secretion in B. longum NCC2705118-120
• 5.3.3 Cellular functional assay of the IL-10 expressed by Sec-modified transformant120-122
• 5.4 Discussion122-124
• 5.5 Summary124-125
• Chapter Ⅵ: Summary, conclusion and suggestion125-132
• 6.1 Summary125-130
• 6.1.1 Overexpression of sHsp(hsp 20 BL05763) in B. longum NCC2705125
• 6.1.2 Heat-stress tolerance of sHsp-overproducing B. longum NCC2705125-126
• 6.1.3 Salt-stress tolerance of sHsp-overproducing B. longum NCC2705126
• 6.1.4 Multiple stress tolerance of Hsp20-overexpressing B. longum NCC2705126-127
• 6.1.5 pDP870-IL-10 expression vector127
• 6.1.6 Transformation of heterologous IL-10 expression vector in B. longum NCC2705127
• 6.1.7 RNA isolation and sqRT-PCR for IL-10127
• 6.1.8 pDP870-secDFexpression vector127-128
• 6.1.9 pDP870-secDF-IL-10 co-expression vector128
• 6.1.10 Transformation of expression vector and modification of sec machinary in B.longum NCC2705128
• 6.1.11 RNA isolation and sqRT-PCR for secDF and IL-10128
• 6.1.12 Protein expression in B.longum NCC2705128-129
• 6.1.13 Western blot129
• 6.1.14 Cellular functional assay of the IL-10 expressed by sec-modified transformant129-130
• 6.2 Conclusion130-131
• 6.3 Suggestion131-132
• Literature cited132-152
• Acknowledgements152-154
• Curriculum Vitae154-156

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉長建;姜波;劉秋;;益生菌保健和治療作用的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年20期

2 張董燕;季海峰;王四新;劉輝;王晶;單達(dá)聰;王雅民;;2株不同源羅伊氏乳桿菌生物學(xué)特性的比較分析[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年08期

3 金紅星;田楠;成文玉;楊希寅;;微生物發(fā)酵合成γ-氨基丁酸的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年11期

4 劉文曙;郭傳tx;;荷瘤裸鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌乏氧狀況的初步研究[J];北京口腔醫(yī)學(xué);2009年01期

5 劉建蒙;李宏田;;剖宮產(chǎn)與子代健康[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年03期

6 李宜輝;微生態(tài)制劑在消化系統(tǒng)疾病的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];重慶醫(yī)學(xué);2004年05期

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10 張春華;朱艷珊;;乳酸菌陰道膠囊在念珠菌性陰道炎治療中的作用[J];放射免疫學(xué)雜志;2011年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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2 葉小蘭;李鵬成;楊倩;;枯草芽孢桿菌拮抗病原菌粘附和入侵Caco-2細(xì)胞的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)分會第十六次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

3 周志剛;;魚類消化道微生物結(jié)構(gòu)與功能研究綜述[A];動物營養(yǎng)研究進(jìn)展（2012年版）[C];2012年

4 孫曉紅;王海香;;乳類食品中抗生素殘留及對嬰幼兒腸道菌群的影響[A];營養(yǎng)健康新觀察（第三十八期）：營養(yǎng)因素與骨髓健康[C];2009年

5 張琳;李杰;劉延國;;益生菌微生態(tài)制劑及其微囊化的研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物微生態(tài)學(xué)分會第十一次全國學(xué)術(shù)研討會暨第五屆會員代表大會論文集[C];2014年

6 張琳;負(fù)婷婷;李杰;梁新曉;李愛科;綦文濤;;微囊化釀酒酵母體外性能評價及其在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物微生態(tài)學(xué)分會第十一次全國學(xué)術(shù)研討會暨第五屆會員代表大會論文集[C];2014年

7 蔡若鵬;楊桂連;王春鳳;;乳酸菌作為口服藥用蛋白載體的應(yīng)用研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物微生態(tài)學(xué)分會第十一次全國學(xué)術(shù)研討會暨第五屆會員代表大會論文集[C];2014年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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5 曾誠;二苯乙烯苷對炎癥性腸病的作用:誘導(dǎo)PPAR-γ和抑制NF-κB炎癥通路[D];華中科技大學(xué);2011年

6 許飛利;我國食品工業(yè)常用益生乳酸菌菌種分型與溯源數(shù)據(jù)庫的研究[D];江南大學(xué);2011年

7 汪本凡;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在小鼠肝癌進(jìn)展中的作用及其在瘧原蟲介導(dǎo)的小鼠肝癌治療中的地位[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2011年

8 吳重德;干酪乳桿菌抵御酸脅迫的生理機(jī)制解析[D];江南大學(xué);2012年

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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6 王雯雯;魚類腸道可定植乳酸桿菌分子生態(tài)的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

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10 付娟;膽固醇氧化酶的異源表達(dá)和應(yīng)用研究[D];山東大學(xué);2011年

，

本文編號：970049