發(fā)布時(shí)間：2017-09-28 13:13

  本文關(guān)鍵詞：Bradyrhizobium diazoefficiens 4534和4222菌株選擇性結(jié)瘤的分子生物學(xué)機(jī)理比較研究

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【摘要】：根瘤菌選擇性結(jié)瘤的分子機(jī)理是長期關(guān)注的熱點(diǎn),也是制約根瘤菌發(fā)揮固氮應(yīng)用潛能的關(guān)鍵所在。多年的研究使我們初步掌握了根瘤菌選擇性結(jié)瘤的基本過程及其影響因子,并獲得了多個(gè)與根瘤菌共生、固氮和選擇性結(jié)瘤相關(guān)的基因。但是對根瘤菌株基因之間的相互聯(lián)系、菌株基因的遺傳、調(diào)控和表達(dá)差異以及基因與宿主的相互作用等方面缺乏全面系統(tǒng)的了解。本研究以與大豆品種中黃13存在結(jié)瘤能力顯著差異的Bradyrhizobium diazoefficiens的兩株菌為材料,在比較基因組學(xué)的基礎(chǔ)上,采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法進(jìn)行了大豆根系分泌物處理下的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)差異分析,以進(jìn)一步揭示根瘤菌的選擇性結(jié)瘤機(jī)理及其主要影響因子。本研究取得主要結(jié)果如下：1.本研究設(shè)計(jì)并改進(jìn)了一種高效促進(jìn)大豆結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制備方法。根瘤菌誘導(dǎo)試驗(yàn)的難點(diǎn)之一就是如何獲得有效的大豆根際分泌誘導(dǎo)物,這是保證后續(xù)研究結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的關(guān)鍵因素。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、改進(jìn)并最終獲得了一種高效促進(jìn)大豆結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制備方法,提高了分泌物的收集提取效率。應(yīng)用上述所建立的技術(shù)方法成功收集了中黃13的根系分泌物,經(jīng)其誘導(dǎo)后菌株的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果證明,所建立根系分泌物制備可行高效。2.完成了B. diazoefficiens 4534和B. diazoefficiens 4222基因組測序,初步了解了它們的基因組特性�；蚪M分析表明它們均由一個(gè)單復(fù)制子構(gòu)成,染色體上各含有三個(gè)核糖體操縱子,G+C含量分別為65.0%和64.9%,基因的平均長度分別為903 bp和901 bp,分別預(yù)測出8072個(gè)和8233個(gè)ORF；但兩基因組中均有近一半未知功能的ORF,為系統(tǒng)分析根瘤菌基因信息帶了一定困難：分析發(fā)現(xiàn)兩菌株間在直系統(tǒng)同源基因上有大量差異,這可能與結(jié)瘤差異等過程相關(guān)。3.首次從比較基因組層面較深入系統(tǒng)揭示了大豆根瘤菌B. diazoefficiens 4534B.diazoefficiens 4222選擇性結(jié)瘤能力差異的可能分子差別。比較分析基因組發(fā)現(xiàn)這兩菌株間存在大量差異直系統(tǒng)同源基因,顯示它們選擇性結(jié)瘤能力差異的可能分子差別,主要涉及脯氨酸代謝、甘露醇、磷酸鹽和鉬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、群集效應(yīng)和IAA謝等過程。這可能是含有更多功能基因的B.diazoefficiens 4534菌株具有更高的選擇性結(jié)瘤能力的潛在原因。4.較全面開展了大豆根瘤菌B. diazoefficiens 4534和5. diazoefficiens 4222選擇性結(jié)瘤分子機(jī)理的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果表明：在大豆根系分泌物的處理下,菌株4534有65個(gè)差異表達(dá)蛋白,菌株4222有29個(gè)差異表達(dá)蛋白。與菌株4222相比,菌株4534產(chǎn)生更多種類和數(shù)量上的差異蛋白；差異蛋白的分析推斷,可能是S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、PhyR-σEcfG調(diào)節(jié)子、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鞭毛蛋白、分子伴侶、與氧化還原狀態(tài)維持相關(guān)的蛋以及一些未知蛋白使得B.diazoefficiens4534具有更高的選擇性結(jié)瘤能力；大豆根系分泌物的作用不僅局限于對大豆根瘤菌結(jié)瘤基因表達(dá)的誘導(dǎo),還與新陳代謝和環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的蛋白／酶的表達(dá)正相關(guān)。5.完成了B. diazoefficiens 4534和5. diazoefficiens 4222轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果表明：在根系分泌物的誘導(dǎo)下菌株4534有457個(gè)顯著差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因253個(gè),下調(diào)基因204個(gè)。而菌株4222只有293個(gè)顯著差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因108個(gè),下調(diào)基因185個(gè)；兩菌株差異表達(dá)基因的GO功能富集分類、代謝途徑分析和KEGG富集分析結(jié)果顯示,在根系分泌物的誘導(dǎo)下,菌株4534中與鞭毛合成、信號刺激和趨性相關(guān)的基因表達(dá)差異顯著,菌株4222中只有與鞭毛合成相關(guān)的基因表達(dá)差異顯著。
【關(guān)鍵詞】：大豆根瘤菌 選擇性結(jié)瘤 結(jié)瘤能力 基因組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué) 轉(zhuǎn)錄組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q939.114
【目錄】：

• 附件5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-16
• 英文縮略表16-17
• 第一章 緒論17-35
• 1.1 根瘤菌選擇性結(jié)瘤的意義17
• 1.2 根瘤菌選擇性結(jié)瘤的分子基礎(chǔ)17-22
• 1.2.1 選擇性結(jié)瘤的概念17-18
• 1.2.2 選擇性結(jié)瘤的過程18-19
• 1.2.3 結(jié)瘤信號的感知19-22
• 1.2.4 根瘤菌結(jié)瘤誘導(dǎo)物質(zhì)的研究22
• 1.3 根瘤菌選擇性結(jié)瘤的影響因素研究進(jìn)展22-25
• 1.3.1 根瘤菌基因型對選擇性結(jié)瘤能力的影響23-25
• 1.3.2 植物基因型對根瘤菌競爭結(jié)瘤能力的影響25
• 1.3.3 環(huán)境因素25
• 1.4 根瘤菌基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展25-32
• 1.4.1 根瘤菌基因組學(xué)研究進(jìn)展26-28
• 1.4.2 根瘤菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展28-30
• 1.4.3 根瘤菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展30-32
• 1.5 選題目的和意義32-34
• 1.6 本研究的技術(shù)路線34-35
• 第二章 Bradyrhizobium diazoefficiens選擇性結(jié)瘤驗(yàn)證及有效根系分泌物提取35-47
• 2.1 材料與方法35-39
• 2.1.1 試驗(yàn)材料35
• 2.1.2 儀器與試劑35-36
• 2.1.3 大豆根瘤菌驗(yàn)證試驗(yàn)36-37
• 2.1.4 菌株的分離、純化和保存37
• 2.1.5 總DNA的提取37
• 2.1.6 BOX-PCR37-38
• 2.1.7 大豆根系分泌物的收集38
• 2.1.8 大豆根系分泌物有效性評價(jià)38-39
• 2.2 結(jié)果與分析39-46
• 2.2.1 大豆根瘤菌株驗(yàn)證試驗(yàn)39-40
• 2.2.2 總DNA的提取40-41
• 2.2.3 BOX-PCR結(jié)果41
• 2.2.4 大豆根系分泌物收集裝置41-42
• 2.2.5 nod基因的誘導(dǎo)42-46
• 2.3 討論46-47
• 第三章 Bradyrhizobium diazoefficiens選擇性結(jié)瘤分子機(jī)理的比較基因組學(xué)分析47-62
• 3.1 試驗(yàn)材料和方法47-49
• 3.1.1 菌株47
• 3.1.2 基因組DNA的提取47
• 3.1.3 根瘤菌基因組序列的測定47-48
• 3.1.4 基因組的注釋與分析48-49
• 3.2 結(jié)果和分析49-61
• 3.2.1 基因組組裝49
• 3.2.2 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控49-51
• 3.2.3 基因組組裝結(jié)果51-52
• 3.2.4 基因組預(yù)測結(jié)果52-53
• 3.2.5 RNA的預(yù)測與分析53-54
• 3.2.6 基因功能注釋與比較54-57
• 3.2.7 基因組系統(tǒng)發(fā)育分析57-58
• 3.2.8 直系同源分析58-59
• 3.2.9 兩根瘤菌基因組差異分析59-61
• 3.3 討論61-62
• 第四章 Bradyrhizobium diazoefficiens選擇性結(jié)瘤分子機(jī)理的蛋白質(zhì)組學(xué)分析62-77
• 4.1 試驗(yàn)材料62
• 4.2 試驗(yàn)方法62-67
• 4.2.1 主要儀器設(shè)備62-63
• 4.2.2 主要試劑及配制63-65
• 4.2.3 根瘤菌生長曲線的測定65
• 4.2.4 根系分泌物對根瘤菌的誘導(dǎo)65-66
• 4.2.5 根瘤菌蛋白的提取66
• 4.2.6 蛋白質(zhì)雙向電泳和染色66
• 4.2.7 蛋白質(zhì)凝膠圖像分析66
• 4.2.8 差異蛋白的質(zhì)譜分析和鑒定66-67
• 4.3 結(jié)果與分析67-75
• 4.3.1 根瘤菌生長曲線測定67
• 4.3.2 根瘤菌蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜分析67-70
• 4.3.3 大豆根系分泌物誘導(dǎo)的根瘤菌差異蛋白的質(zhì)譜鑒定70-73
• 4.3.4 兩根瘤菌經(jīng)大豆根系分泌物誘導(dǎo)后差異蛋白的比較73-75
• 4.4 討論75-77
• 第五章 Bradyrhizobium diazoefficiens選擇性結(jié)瘤分子機(jī)理的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析77-94
• 5.1 試驗(yàn)材料77
• 5.2 試驗(yàn)方法77-79
• 5.2.1 大豆根系分泌物的收集77
• 5.2.2 菌體的培養(yǎng)和誘導(dǎo)77
• 5.2.3 總RNA的提取77
• 5.2.4 RNA質(zhì)量檢測77
• 5.2.5 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建和測序77-78
• 5.2.6 與測序基因組比對78
• 5.2.7 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異分析78
• 5.2.8 基因組的注釋與分析78-79
• 5.3 結(jié)果和分析79-92
• 5.3.1 根系分泌物對根瘤菌的誘導(dǎo)79
• 5.3.2 根瘤菌RNA的提取79-80
• 5.3.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控80-81
• 5.3.4 與基因組數(shù)據(jù)比對81
• 5.3.5 根瘤菌表達(dá)差異分析81-82
• 5.3.6 差異基因表達(dá)模式聚類82-83
• 5.3.7 差異基因功能注釋與比較83-88
• 5.3.8 兩根瘤菌基因表達(dá)差異分析88-92
• 5.4 討論92-94
• 第六章 全文結(jié)論和展望94-97
• 6.1 全文結(jié)論94-95
• 6.2 展望95-97
• 參考文獻(xiàn)97-113
• 致謝113-114
• 作者簡歷114

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 肖文麗;關(guān)大偉;李俊;曹鳳明;陳慧君;;采用gfp和rfp基因標(biāo)記評價(jià)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤能力[J];大豆科學(xué);2010年03期

2 ;Analysis of Two Bradyrhizobium japonicum Strains with Different Symbiotic Matching for Nodulation by Primary Proteomic[J];Journal of Integrative Agriculture;2012年08期

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本文編號：936028