本文關(guān)鍵詞：擬南芥AtCYSb相互作用蛋白的篩選及生物學(xué)功能研究

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【摘要】：半胱氨酸蛋白酶抑制劑普遍存在于動(dòng)物,植物和微生物體內(nèi),它在蛋白質(zhì)水解,蛋白酶活性調(diào)節(jié)等許多生理過(guò)程中起著重要的作用。之前人們對(duì)半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究主要集中在抗病抗蟲(chóng)害方面,但是近些年來(lái),人們逐漸發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑在植物逆境防御過(guò)程中也起著重要的作用,因此探求和挖掘半胱氨酸蛋白酶抑制劑在植物逆境防御中的這種抗逆機(jī)理和潛在的作用對(duì)象具有十分重要的意義。AtCYSb是擬南芥中的一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑,GUS染色結(jié)果表明AtCYSb在萌發(fā)的種子,年幼的葉,花藥,種莢和成熟的葉,莖,種莢里均有表達(dá),這表明它是植物生長(zhǎng)周期里一個(gè)十分活躍的基因。另外前期的研究結(jié)果表明它可以受鹽,堿和氧化等多種逆境脅迫的誘導(dǎo)表達(dá),且在擬南芥中過(guò)量表達(dá)AtCYSb可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽,堿和氧化等逆境脅迫的耐受性,這說(shuō)明AtCYSb在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的過(guò)程中起著重要的作用。為了探求和尋找AtCYSb轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的這種抗逆機(jī)理以及它潛在的作用對(duì)象,我們對(duì)其進(jìn)行了酵母雙雜交篩選并得到了一個(gè)與其具有相互作用的蛋白,鈣離子依賴性的核酸酶AtCaN2,同時(shí)利用酵母共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),體外pull-down實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AtCYSb與AtCaN2之間的相互作用。AtCaN2的酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明,AtCaN2對(duì)雙鏈DNA (dsDNA),單鏈DNA(ssDNA),環(huán)形質(zhì)粒,rRNA,mRNA和tRNA等多種底物均具有降解能力,且AtCaN2降解RNA的速率快于DNA。除了鈣離子之外,AtCaN2的酶活性還可以依賴鎂離子和錳離子,以及鈣離子+鎂離子和鈣離子+錳離子雙離子條件,但是鋅離子和金屬螯合劑EDTA可以抑制AtCaN2的酶活性。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明AtCaN2氨基酸序列中的天冬氨酸和精氨酸位點(diǎn)在保持其核酸酶活性上起著重要作用。UREA-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AtCaN2是一種從3'端往5'端酶解的外切核酸酶。另外實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn),AtCaN2的酶活性可以一定程度上被AtCYSb的抑制,這進(jìn)一步說(shuō)明了AtCYSb和AtCaN2之間存在著相互作用關(guān)系。AtCaN2的生物學(xué)功能研究表明,AtCaN2也可以受鹽,堿,滲透和氧化等多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)GUS染色也顯示AtCaN2在種子,花,莖,衰老的葉等多個(gè)時(shí)期和組織器官中有表達(dá)且逆境脅迫可以提高GUS的表達(dá)量,這說(shuō)明AtCaN2基因也與逆境相關(guān)。另外在酵母里的功能研究表明過(guò)表達(dá)AtCaN2會(huì)導(dǎo)致酵母對(duì)鹽脅迫的敏感性。在擬南芥里的功能研究表明過(guò)表達(dá)AtCaN2也會(huì)導(dǎo)致擬南芥對(duì)鹽,堿和氧化等多種逆境脅迫的敏感性,而突變掉該基因則會(huì)提高植株對(duì)鹽,堿和氧化等多種逆境脅迫的抗性,同時(shí)生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果也表明,在逆境脅迫條件下,AtCaN2過(guò)表達(dá)植株更易受到逆境脅迫的傷害,導(dǎo)致其體內(nèi)葉綠素更容易流失,并積累較高的丙二醛和活性氧含量,同時(shí)產(chǎn)生更多壞死的細(xì)胞,而AtCaN2突變體植株的這些指標(biāo)則好于對(duì)照,這說(shuō)明AtCaN2在植物逆境脅迫過(guò)程中起著負(fù)調(diào)控作用。此外,我們?cè)谔角驛tCYSb抗逆機(jī)理及作用對(duì)象的同時(shí)還得到了它的一個(gè)相互作用蛋白60S核糖體蛋白(AtRP12C),酵母共轉(zhuǎn)化,BiFC和Pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了AtCYSb與AtRP12C蛋白之間的相互作用。我們對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)特性的初步研究,研究表明,AtRP12C基因在種子里的表達(dá)量比較高,在葉中的表達(dá)量較低,并且AtRP12C基因也可以受鹽,堿,滲透和氧化等多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá),說(shuō)明AtRP12C也是一個(gè)與逆境相關(guān)的基因。
【關(guān)鍵詞】：半胱氨酸蛋白酶抑制劑 鈣離子依賴性核酸酶 酵母雙雜交 60S核糖體蛋白 非生物逆境脅迫 核酸酶活性 擬南芥
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q946
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 緒論12-21
• 1.1 植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑12-17
• 1.1.1 植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑的抑制機(jī)制12-14
• 1.1.2 植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑的生物學(xué)功能14-17
• 1.2 核酸酶17-20
• 1.2.1 核酸酶的分子量和結(jié)構(gòu)特性17
• 1.2.2 核酸酶的溫度等電點(diǎn)和pH條件17-18
• 1.2.3 核酸酶的金屬離子和底物特異性18-20
• 1.3 本研究的目的和意義20-21
• 2 擬南芥AtCYSb與鈣離子依賴性的核酸酶AtCaN2的相互作用研究21-42
• 2.1 材料和方法21-27
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法22-27
• 2.2 結(jié)果與分析27-41
• 2.2.1 擬南芥AtCYSb基因序列的生物信息學(xué)分析27-31
• 2.2.2 AtCYSb啟動(dòng)子表達(dá)特性研究31-36
• 2.2.3 AtCYSb蛋白的亞細(xì)胞定位分析36-37
• 2.2.4 AtCYSb與AtCaN2相互作用的驗(yàn)證37-41
• 2.3 本章小結(jié)41-42
• 3 鈣離子依賴性核酸酶AtCaN2酶活特性分析42-64
• 3.1 材料和方法42-47
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法43-47
• 3.2 結(jié)果與分析47-63
• 3.2.1 His-AtCaN2蛋白的大量誘導(dǎo)和純化47-49
• 3.2.2 His-AtCaN2點(diǎn)突變蛋白的大量誘導(dǎo)和純化49-50
• 3.2.3 GST-AtCYSb蛋白的大量誘導(dǎo)和純化50-51
• 3.2.4 核酸酶AtCaN2的酶活性分析51-58
• 3.2.5 AtCYSb對(duì)AtCaN2的酶活性的影響58-62
• 3.2.6 AtCaN2外切核酸酶特性的鑒定62-63
• 3.3 本章小結(jié)63-64
• 4 擬南芥鈣離子依賴性核酸酶AtCaN2的生物學(xué)功能解析64-90
• 4.1 材料和方法64-67
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料64
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法64-67
• 4.2 結(jié)果與分析67-88
• 4.2.1 擬南芥AtCaN2基因序列的生物信息學(xué)分析67-71
• 4.2.2 AtCaN2表達(dá)特性研究71-76
• 4.2.3 AtCaN2蛋白的亞細(xì)胞定位分析76-77
• 4.2.4 AtCaN2基因在酵母中的功能分析77-79
• 4.2.5 AtCaN2轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析79-84
• 4.2.6 AtCaN2轉(zhuǎn)基因擬南芥生理指標(biāo)的測(cè)定84-88
• 4.3 本章小結(jié)88-90
• 5 AtCYSb與60S核糖體蛋白AtRP12C的相互作用研究90-104
• 5.1 材料和方法90-92
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料90
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法90-92
• 5.2 結(jié)果與分析92-103
• 5.2.1 擬南芥AtRP12C基因序列的生物信息學(xué)分析92-95
• 5.2.2 AtRP12C蛋白的亞細(xì)胞定位分析95
• 5.2.3 His-AtRP12C融合蛋白的誘導(dǎo)和純化95-97
• 5.2.4 AtCYSb與AtRP12C相互作用的驗(yàn)證97-100
• 5.2.5 AtRP12C表達(dá)特性研究100-103
• 5.3 本章小結(jié)103-104
• 6 討論104-108
• 6.1 AtCaN2的酶活特性分析104-105
• 6.2 AtCaN2在植物對(duì)逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮的作用105-106
• 6.3 AtCYSb與AtCaN2在逆境脅迫中的相互作用機(jī)制106-107
• 6.4 AtRP12C在逆境脅迫中的初步研究107
• 6.5 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)107-108
• 結(jié)論108-109
• 參考文獻(xiàn)109-126
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文126-127
• 致謝127-128

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 郭坤元;擬南芥AtCYSb相互作用蛋白的篩選及生物學(xué)功能研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：896505