本文關(guān)鍵詞：Hsa-miR-200a調(diào)控紅細(xì)胞分化的功能及分子機(jī)制研究

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【摘要】：人體每天產(chǎn)生約1011個紅細(xì)胞以滿足機(jī)體輸送氧氣和二氧化碳,同時維持酸堿平衡等生理需求。紅細(xì)胞生成異常將會導(dǎo)致鐮刀型貧血癥、地中海貧血癥等嚴(yán)重危害人類健康的疾病。因此,對紅細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制的研究極其重要。大部分紅細(xì)胞生成于骨髓當(dāng)中,骨髓中的造血干細(xì)胞經(jīng)一系列分化并產(chǎn)生不同階段細(xì)胞,最終脫核成為成熟紅細(xì)胞。這一正常生理過程受到細(xì)胞微環(huán)境、染色質(zhì)構(gòu)象和活性、生長因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、非編碼RNA等諸多因素的調(diào)控,復(fù)雜而精密。MicroRNA(miRNA)是近年來研究較為熱門的一類具有調(diào)控基因表達(dá)功能的非編碼RNA。本文通過系統(tǒng)挖掘紅細(xì)胞不同分化發(fā)育階段紅系母細(xì)胞的miRNA組學(xué)測序數(shù)據(jù),探索miRNA調(diào)控紅細(xì)胞分化的分子機(jī)制。最終確定7個具有潛在調(diào)控紅細(xì)胞分化功能的miRNA.利用人臍血來源的CD34+造血干細(xì)胞體外紅系分化.Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞紅系分化、促紅細(xì)胞生成素(EPO)誘導(dǎo)的TF-1細(xì)胞紅系分化等細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,最終確定hsa-miR-200a為我們的研究對象。通過過表達(dá)miR-200a,我們發(fā)現(xiàn)無論是在紅系K562還是在TF-1細(xì)胞中,miR-200a都能夠抑制多個珠蛋白基因和紅系調(diào)控因子GATA-1、KLF1的表達(dá)。利用EPO對TF-1細(xì)胞進(jìn)行紅系分化誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)在紅細(xì)胞分化過程中過表達(dá)miR-200a能夠抑制珠蛋白基因表達(dá)、CD235a和CD71在細(xì)胞表面表達(dá)。過表達(dá)miR-200a的TF-1細(xì)胞在紅系分化中血紅蛋白濃度增長速率也顯著慢于對照細(xì)胞。由此證實(shí)miR-200a能夠抑制紅系分化。此外,我們還利用Ion Proton測序平臺對過表達(dá)niR-200a的TF-1細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序研究,功能聚類與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等分析結(jié)果均進(jìn)一步證實(shí)了miR-200a對紅細(xì)胞分化的影響作用。為進(jìn)一步明確miR-200a調(diào)控紅細(xì)胞分化的分子機(jī)制,我們結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫來篩選miR-200a的候選靶基因。最終確定了PDCD4和THRB為miR-200a候選靶基因。通過對這兩個候選靶基因表達(dá)的檢測、雙熒光素酶報告系統(tǒng)的分析和RISC-IP實(shí)驗(yàn)評估等,最終證實(shí)miR-200a靶向PDCD4和THRB的生物學(xué)作用。進(jìn)一步,在K562細(xì)胞中對PDCD4和THRB分別進(jìn)行了過表達(dá)和敲低處理,以研究兩者的生物學(xué)功能。結(jié)果表明：過表達(dá)PDCD4或THRB能夠促進(jìn)珠蛋白和GATA-1、KLF1基因的表達(dá)：而敲低則相反。這一調(diào)控結(jié)果同miR-200a的調(diào)控效應(yīng)可以相互印證。綜上,我們從miRNA組學(xué)數(shù)據(jù)出發(fā),首先明確潛在調(diào)控紅細(xì)胞分化的miRNA。結(jié)合不同紅系分化研究模型的功能實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析,證實(shí)了miR-200a具有調(diào)控紅細(xì)胞分化的功能。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明,PDCD4和THRB是niR-200a的靶基因,且兩者也具有調(diào)控紅細(xì)胞分化的功能。由此,miR-200a可通過靶向PDCD4和THRB調(diào)控紅細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：紅細(xì)胞分化 hsa-miR-200a PDCD4 THRB 轉(zhuǎn)錄組測序
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q343
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 專業(yè)詞匯中英文對照11-16
• 第一章 緒論16-36
• 1.1 紅細(xì)胞分化和發(fā)育的概述17-26
• 1.1.1 紅細(xì)胞分化發(fā)育基本過程17-19
• 1.1.2 紅細(xì)胞分化調(diào)控的研究19-25
• 1.1.3 紅細(xì)胞分化和發(fā)育異常引起的疾病及治療25-26
• 1.2 microRNA調(diào)控紅細(xì)胞分化的研究進(jìn)展26-29
• 1.2.1 正調(diào)控紅細(xì)胞分化的microRNA27-28
• 1.2.2 負(fù)調(diào)控紅細(xì)胞分化的microRNA28
• 1.2.3 microRNA調(diào)控紅細(xì)胞分化的主要研究方法28-29
• 1.3 Hsa-miR-200a的研究進(jìn)展29-31
• 1.3.1 miR-200a在癌癥中的功能研究30-31
• 1.3.2 miR-200a在細(xì)胞分化中的功能研究31
• 1.4 PDCD4的研究進(jìn)展31-32
• 1.4.1 PDCD4在腫瘤中的功能研究31
• 1.4.2 PDCD4在細(xì)胞分化中的功能研究31-32
• 1.5 THRB的研究進(jìn)展32-36
• 1.5.1 TRβ作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子32
• 1.5.2 TRβ的生理功能32-36
• 第二章 材料和方法36-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器36-38
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材36-37
• 2.1.2 試劑盒37
• 2.1.3 常用溶液和培養(yǎng)基37-38
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器38
• 2.2 質(zhì)粒38-43
• 2.2.1 用于基因過表達(dá)的質(zhì)粒38-39
• 2.2.2 用于基因敲低的質(zhì)粒39-40
• 2.2.3 用于雙熒光素酶報告檢測的質(zhì)粒40
• 2.2.4 質(zhì)粒的構(gòu)建40-42
• 2.2.5 突變型pGL3-CMV-luc-3'UTR質(zhì)粒的獲得42-43
• 2.3 細(xì)胞43-48
• 2.3.1 細(xì)胞來源43-44
• 2.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存44-45
• 2.3.3 細(xì)胞紅系分化誘導(dǎo)45-46
• 2.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染46-47
• 2.3.5 穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建47-48
• 2.4 基因表達(dá)的檢測48-52
• 2.4.1 miRNA熒光實(shí)時定量PCR48-50
• 2.4.2 mRNA熒光實(shí)時定量PCR50-51
• 2.4.3 免疫印跡技術(shù)(western blot)51-52
• 2.4.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面CD235a和CD71表達(dá)52
• 2.5 細(xì)胞血紅蛋白濃度檢測52-53
• 2.6 miRNA靶基因鑒定53-54
• 2.6.1 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)53
• 2.6.2 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體-免疫共沉淀技術(shù)(RISC-IP)53-54
• 2.7 高通量測序54-55
• 2.7.1 轉(zhuǎn)錄組測序54
• 2.7.2 miRNA組測序54-55
• 2.7.3 數(shù)據(jù)分析55
• 2.8 統(tǒng)計學(xué)分析55-56
• 第三章 結(jié)果與討論56-82
• 3.1 篩選調(diào)控紅細(xì)胞分化的miRNA56-61
• 3.1.1 從HESC到PBER的miRNA數(shù)據(jù)中篩選候選miRNA56-57
• 3.1.2 候選miRNA在其它紅細(xì)胞分化研究模型中的表達(dá)譜57-61
• 3.2 miR-200a調(diào)控紅細(xì)胞分化61-66
• 3.2.1 K562中過表達(dá)miR-200a抑制珠蛋白基因表達(dá)61-62
• 3.2.2 TF-1中過表達(dá)miR-200a抑制珠蛋白及紅系重要基因的表達(dá)62-63
• 3.2.3 miR-200a抑制誘導(dǎo)的TF-1紅系分化63-66
• 3.3 miR-200a調(diào)控TF-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究66-71
• 3.3.1 轉(zhuǎn)錄組分析概況66-67
• 3.3.2 轉(zhuǎn)錄組功能分析進(jìn)一步證實(shí)miR-200a對紅系分化的影響67-71
• 3.4 miR-200a的靶基因篩選71-72
• 3.5 PDCD4是miR-200a的一個靶基因72-75
• 3.5.1 miR-200a抑制PDCD4表達(dá)72-73
• 3.5.2 miR-200a能夠結(jié)合在PDCD4的3'-UTR上73-75
• 3.6 THRB是miR-200a的一個靶基因75-76
• 3.7 miR-200a靶基因的功能研究76-82
• 3.7.1 PDCD4的功能研究76-78
• 3.7.2 THRB的功能研究78-82
• 第四章 結(jié)論82-84
• 參考文獻(xiàn)84-100
• 附錄100-120
• 作者簡介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果120-121

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Weiqi Tan;Yang Li;Seng-Gee Lim;Theresa MC Tan;;miR-106b-25/miR-17-92 clusters: Polycistrons with oncogenic roles in hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2014年20期

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本文編號：869661