本文關(guān)鍵詞：兩種二十面體病毒MCMV、CarMV衣殼結(jié)構(gòu)及MCMV復(fù)制位點(diǎn)的電鏡三維重構(gòu)研究

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【摘要】：玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus, MCMV)和麝香石竹斑駁病毒(Carnation mottle virus, CarMV)分別是番茄叢矮病毒科Tombusviridae玉米褪綠斑駁病毒屬M(fèi)achlomovirus和麝香石竹斑駁病毒屬Carmovirus代表成員。本研究利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)對(duì)MCMV、CarMV病毒粒子進(jìn)行三維重構(gòu),同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)的電子顯微技術(shù),對(duì)MCMV細(xì)胞內(nèi)復(fù)制場(chǎng)所及細(xì)胞病理進(jìn)行探索。應(yīng)用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)對(duì)MCMV病毒粒子的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,獲得該病毒粒子3.6埃分辨率的結(jié)構(gòu),揭示了衣殼蛋白亞基C-端序列的空間位置,顯示了MCMV不對(duì)稱單元的高度緊湊性。結(jié)合病毒粒子表面2-次對(duì)稱軸附近的縫隙,說(shuō)明不對(duì)稱單元在MCMV結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起著非常重要的作用。通過(guò)與其他病毒表面結(jié)構(gòu)特征比較,分析了暴露于病毒粒子表面的殘基位點(diǎn),揭示了該病毒與介體傳播相關(guān)的功能位點(diǎn),為進(jìn)一步研究MCMV的傳播機(jī)制提供了必要的結(jié)構(gòu)證據(jù)。同時(shí)對(duì)獲得的番茄叢矮病毒科與南方大豆花葉病毒屬Sobemovirus 12種病毒的衣殼蛋白,進(jìn)行氨基酸序列,亞基結(jié)構(gòu)及二十面體結(jié)構(gòu)的比較,發(fā)現(xiàn)MCMV與番茄叢矮病毒科藜屬成員藜花葉病毒(Panicum Mosaic Virus, PMV)具有很近的親緣關(guān)系。同時(shí),利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)對(duì)CarMV在四種條件下(Ca-pH7、EDTA-pH7、Ca-pH5和EDTA-pH5)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行重構(gòu),四個(gè)重構(gòu)之間的結(jié)構(gòu)差異表明鈣離子對(duì)CarMV粒子結(jié)構(gòu)維持不起主要作用。結(jié)合病毒衣殼內(nèi)表面電荷分布,推測(cè)不對(duì)稱單元中心為CarMV基因組脫衣殼提供通道,了解CarMV基因組脫衣殼機(jī)制,對(duì)CarMV引起的病毒病防治具有重要意義。對(duì)感染MCMV的玉米葉片進(jìn)行細(xì)胞病理分析,發(fā)現(xiàn)病毒粒子在細(xì)胞質(zhì)中大量積累,過(guò)氧化物體和線粒體病變顯著：過(guò)氧化物酶體增生并聚集,膜內(nèi)側(cè)形成周邊小泡,后期發(fā)展成多泡體。通過(guò)對(duì)復(fù)制中間產(chǎn)物及復(fù)制酶進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記,確定MCMV基因組復(fù)制發(fā)生在過(guò)氧化物酶體膜周邊小泡內(nèi)。通過(guò)電子斷層成像技術(shù)對(duì)膜周邊小泡結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維重構(gòu),發(fā)現(xiàn)膜周邊小泡結(jié)構(gòu)源于過(guò)氧化物酶體膜內(nèi)陷。同時(shí)發(fā)現(xiàn)多泡體內(nèi)含有尺寸較大且包含無(wú)定形物質(zhì)大泡結(jié)構(gòu),利用電子斷層成像技術(shù)對(duì)相鄰多泡體之間連接進(jìn)行三維重構(gòu),發(fā)現(xiàn)大泡結(jié)構(gòu)源于多泡體膜的局部?jī)?nèi)陷。利用MCMV多克隆抗體對(duì)病毒衣殼蛋白進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記,結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒的衣殼蛋白除了定位在細(xì)胞質(zhì),在大泡中也大量存在,結(jié)合病毒侵染后期多泡體中結(jié)晶狀排列的病毒粒子,推測(cè)MCMV組裝發(fā)生在多泡體大泡中。對(duì)結(jié)晶狀排列病毒粒子的取向進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)病毒粒子通過(guò)圍繞5次對(duì)稱軸loop進(jìn)行相互作用,推測(cè)這種相互作用在病毒粒子組裝及釋放中起著非常重要的作用。線粒體病變主要是囊泡化,在囊泡中積累大量絲狀物質(zhì),且病變程度隨侵染時(shí)間的加長(zhǎng)而加劇。高壓冷凍結(jié)果進(jìn)一步表明,絲狀物質(zhì)在膜間隙中積累導(dǎo)致線粒體縊裂成多個(gè)小線粒體結(jié)構(gòu),推測(cè)MCMV侵染導(dǎo)致了線粒體結(jié)構(gòu)的異常增生。對(duì)MCMV細(xì)胞病理和復(fù)制機(jī)理的電子顯微學(xué)研究,對(duì)揭示MCMV生命周期,進(jìn)一步探索該病毒的侵染機(jī)制提供了理論依據(jù),對(duì)MCMV引起的病毒病防治具有指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：玉米褪綠斑駁病毒 麝香石竹斑駁病毒 三維結(jié)構(gòu) 復(fù)制 細(xì)胞病理學(xué) 單顆粒技術(shù) 電子斷層成像技術(shù) 電子顯微學(xué)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S432.41
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-18
• 1 文獻(xiàn)綜述18-45
• 1.1 冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)18-26
• 1.1.1 三維重構(gòu)的基本原理19-21
• 1.1.2 冷凍制樣技術(shù)21-22
• 1.1.3 冷凍電鏡成像技術(shù)22-23
• 1.1.3.1 反差形成機(jī)制22
• 1.1.3.2 低劑量成像技術(shù)22-23
• 1.1.4 圖像的解調(diào)制23-24
• 1.1.5 冷凍電鏡技術(shù)中的新裝備24-26
• 1.2 電鏡三維重構(gòu)基本方法26-36
• 1.2.1 單顆粒技術(shù)26-31
• 1.2.1.1 基本流程26-27
• 1.2.1.2 二維投影的對(duì)中27
• 1.2.1.3 二維投影的平均化處理27-28
• 1.2.1.4 三維結(jié)構(gòu)的計(jì)算28-29
• 1.2.1.5 分辨率評(píng)估29
• 1.2.1.6 單顆粒技術(shù)的應(yīng)用29-30
• 1.2.1.7 單顆粒技術(shù)存在的主要問(wèn)題及解決30-31
• 1.2.2 電子斷層成像技術(shù)31-36
• 1.2.2.1 電子斷層成像技術(shù)的基本流程31-32
• 1.2.2.2 樣品制備32
• 1.2.2.3 圖像采集32-34
• 1.2.2.4 二維投影的三維重構(gòu)34
• 1.2.2.5 電子斷居成像技術(shù)的應(yīng)用34-35
• 1.2.2.6 電子斷層成像技術(shù)目前存在的問(wèn)題35-36
• 1.3 二十面體病毒的冷凍電鏡研究36-39
• 1.3.1 二十面體病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)36-37
• 1.3.2 二十面體的取向和中心估算37-39
• 1.4 正義RNA病毒復(fù)制機(jī)制研究39-42
• 1.4.1 單鏈正義RNA病毒復(fù)制場(chǎng)所的形態(tài)39-41
• 1.4.2 RNA依賴性的RNA聚合酶結(jié)構(gòu)及機(jī)理41-42
• 1.5 本論文研究的主要內(nèi)容和意義42-45
• 1.5.1 本論文研究的主要內(nèi)容42-43
• 1.5.2 本論文選題的意義43-45
• 2 玉米褪綠斑駁病毒粒子的冷凍電鏡三維重構(gòu)45-85
• 2.1 前言45-46
• 2.2 材料和方法46-55
• 2.2.1 毒源46
• 2.2.2 試劑和設(shè)備46
• 2.2.2.1 試劑和耗材46
• 2.2.2.2 儀器和軟件46
• 2.2.3 病毒的摩擦接種46-47
• 2.2.4 病毒粒子的提純47
• 2.2.4.1 病毒粒子初提純47
• 2.2.4.2 病毒粒子精細(xì)提純47
• 2.2.5 提純病毒樣品的電鏡負(fù)染色觀察47-48
• 2.2.6 冷凍樣品的制備48-50
• 2.2.6.1 冷凍樣品的制備48-49
• 2.2.6.2 冷凍樣品的轉(zhuǎn)移49-50
• 2.2.7 冷凍電鏡圖像采集50-52
• 2.2.7.1 冷凍電鏡狀態(tài)的調(diào)節(jié)50-51
• 2.2.7.2 冷凍電鏡圖像的采集51-52
• 2.2.8 冷凍電鏡圖像處理52
• 2.2.9 冷凍電鏡三維重構(gòu)52-53
• 2.2.10 MCMV氨基酸序列的同源建模53
• 2.2.11 模型的優(yōu)化及驗(yàn)證53-54
• 2.2.12 MCMV衣殼蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)54
• 2.2.13 結(jié)構(gòu)與序列的下載54-55
• 2.2.14 氨基酸序列的多序列對(duì)比及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建55
• 2.3 結(jié)果55-80
• 2.3.1 玉米褪綠斑駁病毒的電鏡負(fù)染色結(jié)果55-56
• 2.3.2 MCMV粒子冷凍電鏡照片質(zhì)量評(píng)估56-57
• 2.3.3 病毒粒子的框選57
• 2.3.4 病毒粒子的CTF校正57-59
• 2.3.5 MCMV初始模板的獲得59-60
• 2.3.6 基于獲得的初始模板對(duì)MCMV重構(gòu)進(jìn)行精修60-63
• 2.3.7 MCMV的三維重構(gòu)結(jié)果63-74
• 2.3.7.1 MCMV粒子的三維結(jié)構(gòu)63-64
• 2.3.7.2 MCMV三維重構(gòu)分辨率的評(píng)估64-66
• 2.3.7.3 不對(duì)稱單元的亞基組成66-67
• 2.3.7.4 MCMV模型的建立67-69
• 2.3.7.5 MCMV重構(gòu)電子密度圖的質(zhì)量69
• 2.3.7.6 潛在的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)69-70
• 2.3.7.7 不對(duì)稱單元之間的相互作用分析70-71
• 2.3.7.8 內(nèi)部核酸結(jié)合位點(diǎn)分析71-73
• 2.3.7.9 表面功能位點(diǎn)分析73-74
• 2.3.8 基于氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)結(jié)果分析74-77
• 2.3.9 基于衣殼蛋白氨基酸序列的進(jìn)化分析77-78
• 2.3.10 基于病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)的分類78-80
• 2.4 討論80-85
• 2.4.1 MCMV粒子的穩(wěn)定因素80-82
• 2.4.2 基因組RNA與病毒衣殼的相互作用82
• 2.4.3 MCMV表面的功能位點(diǎn)分析82-83
• 2.4.4 MCMV的進(jìn)化分析83-85
• 3 麝香石竹斑駁病毒粒子的冷凍電鏡三維重構(gòu)85-106
• 3.1 前言85-86
• 3.2 材料與方法86-90
• 3.2.1 毒源的獲得及鑒定86
• 3.2.2 試劑和設(shè)備86-87
• 3.2.2.1 試劑和耗材86
• 3.2.2.2 儀器和軟件86-87
• 3.2.3 病毒粒子的提純及負(fù)染色觀察87
• 3.2.4 冷凍樣品的制備87-88
• 3.2.4.1 冷凍樣品的制備87-88
• 3.2.4.2 冷凍樣品的轉(zhuǎn)移88
• 3.2.5 冷凍電鏡圖像采集88-90
• 3.2.5.1 冷凍電鏡狀態(tài)的調(diào)節(jié)88-89
• 3.2.5.2 冷凍電鏡圖像的采集89-90
• 3.2.5.3 冷凍電鏡低劑量模式下圖像采集90
• 3.2.6 冷凍電鏡圖像處理90
• 3.2.7 冷凍電鏡三維重構(gòu)90
• 3.3 結(jié)果90-103
• 3.3.1 CarMV粒子的提純及負(fù)染色觀察90-91
• 3.3.2 CarMV粒子冷凍電鏡觀察結(jié)果91-92
• 3.3.3 CarMV粒子的三維結(jié)構(gòu)92-94
• 3.3.4 不對(duì)稱單元內(nèi)亞基相關(guān)性比較94-95
• 3.3.5 CarMV三維結(jié)構(gòu)的大小比較95-96
• 3.3.6 分辨率的評(píng)估96-97
• 3.3.7 不對(duì)稱單元內(nèi)亞基間相互作用比較97-100
• 3.3.8 CarMV粒子內(nèi)部核酸分布分析100-103
• 3.4 討論103-106
• 3.4.1 CarMV冷凍電鏡三維重構(gòu)中的鈣離子分布103
• 3.4.2 CarMV中鈣離子的作用103-104
• 3.4.3 CarMV病毒基因組出殼機(jī)制探索104-106
• 4 玉米褪綠斑駁病毒細(xì)胞病理及復(fù)制機(jī)制電子顯微學(xué)106-143
• 4.1 前言106-107
• 4.2 材料與方法107-120
• 4.2.1 毒源與植物材料107
• 4.2.2 試劑和儀器107-108
• 4.2.2.1 試劑和耗材107
• 4.2.2.2 儀器和軟件107-108
• 4.2.3 摩擦接種108
• 4.2.4 莖桿注射法108
• 4.2.5 電鏡樣品的制備108-110
• 4.2.5.1 常規(guī)電鏡樣品制備方法108-109
• 4.2.5.2 低溫包埋樣品制備方法109
• 4.2.5.3 高壓冷凍樣品制備方法109-110
• 4.2.6 免疫膠體金標(biāo)記110
• 4.2.7 MCMV復(fù)制酶P111的生物信息學(xué)分析110-111
• 4.2.7.1 P111的復(fù)制酶跨膜區(qū)預(yù)測(cè)111
• 4.2.7.2 P111保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)111
• 4.2.7.3 P111蛋白的同源建模111
• 4.2.8 MCMV復(fù)制酶特異性抗體制備111-118
• 4.2.8.1 MCMV復(fù)制酶P111片段的克隆及表達(dá)111-113
• 4.2.8.2 含有目的基因的克隆載體構(gòu)建113-118
• 4.2.9 電子斷層成像技術(shù)118-120
• 4.2.9.1 樣品制備118-119
• 4.2.9.2 TF20透射電鏡狀態(tài)調(diào)節(jié)119
• 4.2.9.3 圖像采集119
• 4.2.9.4 數(shù)據(jù)處理119-120
• 4.3 結(jié)果120-138
• 4.3.1 P111蛋白C端部分序列的原核表達(dá)及蛋白純化120-124
• 4.3.2 感染MCMV的田間玉米細(xì)胞病理變化124-125
• 4.3.3 MCMV侵染玉米中過(guò)氧化物酶體的病變125-128
• 4.3.4 MCMV復(fù)制酶P111的亞細(xì)胞定位分析128-129
• 4.3.5 MCMV復(fù)制中間產(chǎn)物dsRNA亞細(xì)胞定位分析129-130
• 4.3.6 過(guò)氧化物酶體復(fù)制小泡的電子斷層三維重構(gòu)130-132
• 4.3.7 相鄰過(guò)氧化物酶體之間的連接關(guān)系132
• 4.3.8 過(guò)氧化物酶體中無(wú)定形物質(zhì)的免疫膠體金標(biāo)記132-133
• 4.3.9 病毒粒子在細(xì)胞質(zhì)結(jié)晶狀聚集體中的取向分布133-135
• 4.3.10 MCMV侵染對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞能量代謝的影響135-137
• 4.3.11 線粒體病變過(guò)程的模型137-138
• 4.4 討論138-143
• 4.4.1 MCMV復(fù)制酶的亞細(xì)胞定位分析138-139
• 4.4.2 MCMV的RNA復(fù)制場(chǎng)所139-140
• 4.4.3 病毒因子誘導(dǎo)膜增生的機(jī)理140
• 4.4.4 MCMV組裝位點(diǎn)分析140-141
• 4.4.5 MCMV侵染對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)的影響141-143
• 5 全文小結(jié)及研究展望143-145
• 5.1 全文小結(jié)143-144
• 5.2 研究展望144-145
• 附文1 馬鈴薯Y病毒粒子胞間運(yùn)動(dòng)的電子顯微學(xué)證據(jù)145-157
• 1.1 前言145-146
• 1.2 材料與方法146-147
• 1.2.1 試劑和儀器146
• 1.2.1.1 試劑和耗材146
• 1.2.1.2 儀器和設(shè)備146
• 1.2.2 毒源及病毒接種146
• 1.2.3 透射電鏡樣品制備146-147
• 1.2.4 免疫膠體金標(biāo)記147
• 1.2.5 電子斷層成像技術(shù)數(shù)據(jù)收集及圖像處理147
• 1.2.6 同源建模147
• 1.3 結(jié)果147-154
• 1.3.1 Potyvirus柱狀內(nèi)含體的形態(tài)結(jié)構(gòu)147-148
• 1.3.2 病毒衣殼蛋白的免疫膠體金標(biāo)記148-150
• 1.3.3 柱狀內(nèi)含體促進(jìn)病毒粒子穿過(guò)胞間連絲150-152
• 1.3.4 CI與病毒衣殼蛋白互作機(jī)制152-154
• 1.4 討論154-157
• 1.4.1 病毒粒子與柱狀內(nèi)含體的結(jié)合方式154-155
• 1.4.2 病毒粒子的胞間運(yùn)輸形式155-156
• 1.4.3 病毒粒子離開Cl潛在動(dòng)力來(lái)源156-157
• 參考文獻(xiàn)157-177
• 附錄A 縮寫詞及中英文對(duì)照177-179
• 附錄B 常用緩沖液及培養(yǎng)基配方179-183
• 作者簡(jiǎn)歷及其在校期間取得的科研成果183

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本文編號(hào)：844962