本文關(guān)鍵詞：興奮性神經(jīng)元特異性表達(dá)Kir2.1通道通過上調(diào)miR-9抑制FoxP2翻譯而損傷學(xué)習(xí)和記憶

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【摘要】：[背景] 學(xué)習(xí)和記憶是人類大腦最主要的高級功能,其細(xì)胞和分子生物學(xué)機制一直是神經(jīng)科學(xué)研究的重點領(lǐng)域。已知神經(jīng)元是腦的主要構(gòu)成部分,其活性變化與突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性密切相關(guān),而后者是學(xué)習(xí)和記憶形成的基礎(chǔ)。研究表明,在認(rèn)知障礙疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease),帕金森病(Parkinson's disease)中,神經(jīng)元活性降低,突觸可塑性受損,導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。目前,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量表觀遺傳學(xué)因素如老齡化、腦外傷在神經(jīng)元活性降低所引起的學(xué)習(xí)記憶障礙中的作用,但相應(yīng)的作用及其機理尚不明了。隨著基因測序、芯片技術(shù)的飛速發(fā)展,表觀遺傳學(xué)對學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控作用逐漸被揭示。人類大腦有數(shù)千億個神經(jīng)元,這些神經(jīng)元細(xì)胞可以表達(dá)19,814個蛋白相關(guān)基因和數(shù)千個非編碼RNA (non-coding RNAs, ncRNAs)。非編碼RNA的突變或表達(dá)異常與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNAs)作為非編碼RNA的主要成員可作用于神經(jīng)元的許多轉(zhuǎn)錄因子。此外,在神經(jīng)系統(tǒng)中與突觸蛋白合成有關(guān)的基因大多是miRNAs的潛在靶基因,miRNAs可以根據(jù)突觸活性的改變來調(diào)控局部蛋白質(zhì)的翻譯,進(jìn)而調(diào)控突觸的生長和突觸傳遞的強度,但miRNA調(diào)控神經(jīng)元活性介導(dǎo)的學(xué)習(xí)和記憶的機制尚不清楚。 [目的] 運用條件誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)基因小鼠模型,我們將揭示神經(jīng)元活性依賴的海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性調(diào)節(jié)的細(xì)胞分子機制,即在興奮性神經(jīng)元中過表達(dá)內(nèi)向整流性鉀離子通道2.1(Kir2.1)通過上調(diào)microRNA-9(miR-9),抑制其靶基因核轉(zhuǎn)錄因子FoxP2的表達(dá),從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能受損。本研究將為學(xué)習(xí)與記憶障礙相關(guān)疾病的藥物開發(fā)提供有效的分子靶點。 [方法] 我們首先將在北京百奧賽圖公司構(gòu)建的條件誘導(dǎo)性過表達(dá)Ai3-Flag-Kir2.1-2A-tdTomato小鼠(Tg1)與在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)Cre重組酶CamKII-a-CreERT2小鼠(Tg2)雜交,通過PCR方法鑒定為雙雜陽性純合子后代通過他莫昔芬藥物條件性誘導(dǎo)小鼠特異性在興奮性神經(jīng)元過表達(dá)Kir2.1,簡寫為Kir2.1(+)小鼠。通過免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)方法(IFC)、蛋白印跡(Western Blotting)、熒光定量PCR(qPCR)驗證Kir2.1在興奮性神經(jīng)元的過表達(dá)。然后通過腦片膜片鉗電生理技術(shù)檢測Kir2.1(+)小鼠的突觸傳遞可塑性是否受神經(jīng)元活性降低的影響。通過水迷宮(Morris Water Maze Test)、條件性恐懼實驗(Fear Conditioning Test)、T迷宮(T-maze Test)等實驗檢測學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)行為。通過曠場(Open Field Test)、轉(zhuǎn)棒儀(Rotarod)、高架十字迷宮(Elevated Plus Maze)、強迫游泳(Forced Swimming Test)等實驗檢測學(xué)習(xí)和記憶不相關(guān)行為。通過高通量測序(NA-Seq)及有效組內(nèi)對比篩選出與神經(jīng)元活性及學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的基因miR-9和FoxP2。通過熒光定量PCR(qPCR)驗證miR-9在Kir2.1(+)小鼠表達(dá)升高,FoxP2在Kir2.1(+)小鼠表達(dá)下降。通過構(gòu)建野生型和突變型FoxP23'端UTR的熒光素酶表達(dá)載體確認(rèn)miR-9和靶蛋白FoxP23'端UTR區(qū)的直接結(jié)合。通過腦立體定位在海馬齒狀回(Dendrite Gyrus, DG)區(qū)注射LNA-miR-9抑制小鼠海馬內(nèi)源性miR-9的表達(dá)。通過尾靜脈注射PUF-Fox-P抑制miR-9與FoxP2的3'UTR的直接結(jié)合。通過免疫印跡(Western Blotting)檢測給予LNA-9和Fox-P處理后Kir2.1(＋)小鼠FoxP2的蛋白表達(dá)增多。通過熒光定量(qPCR)檢測給予Fox-P處理后Kir2.1(+)小鼠FoxP2的mRNA水平無變化。隨后進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)行為學(xué)及腦片膜片鉗電生理實驗,LNA-9和Fox-P處理組Kir2.1(+)小鼠的學(xué)習(xí)和記憶改善,突觸可塑性恢復(fù)至正常。通過腦立體腦定位在Kir2.1(-)小鼠DG區(qū)注射慢病毒Lenti-miR-9過表達(dá)外源性miR-9,在Kir2.1(＋)小鼠DG區(qū)注射慢病毒Lenti-FoxP2過表達(dá)外源性FoxP2,重復(fù)上述實驗,明確神經(jīng)元活性依賴的miR-9/FoxP2通路導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶缺陷的機制。 [結(jié)果] 我們的研究結(jié)果顯示： (1)成功建立在興奮性神經(jīng)元中過表達(dá)功能性Kir2.1小鼠(Kir2.1(+)小鼠)；(2)Kir2.1(+)小鼠突觸傳遞功能正常,但海馬CA3-CA1環(huán)路LTP異常；(3)Kir2.1(+)小鼠其他表型正常,但學(xué)習(xí)和記憶功能發(fā)生障礙：(4)RNA測序發(fā)現(xiàn)Kir2.1(+)小鼠miR-9表達(dá)增加；(5)miR-9抑制下游靶基因FoxP2的蛋白翻譯；(6)下調(diào)miR-9能改善Kir2.1(+)小鼠學(xué)習(xí)和記功能受損；(7)上調(diào)miR-9導(dǎo)致Kir2.1(-)小鼠學(xué)習(xí)和記憶缺陷；(8)上調(diào)FoxP2改善Kir2.1(+)小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能受損。 [結(jié)論] 興奮性神經(jīng)元過表達(dá)Kir2.1導(dǎo)致神經(jīng)元活性降低,miR-9表達(dá)增多并下調(diào)靶基因FoxP2的蛋白翻譯水平,引起海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性的改變,最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶功能受損。通過抑制miR-9或者上調(diào)靶基因FoxP2的蛋白水平可以逆轉(zhuǎn)因神經(jīng)元活性降低所導(dǎo)致的海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性受損,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)元活性 學(xué)習(xí)和記憶 Kir2.1 高通量測序 miR-9 FoxP2
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R338
【目錄】：

• 目錄4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 材料方法14-47
• 結(jié)果47-66
• 討論66-71
• 小結(jié)71
• 創(chuàng)新點71-72
• 綜述72-90
• 參考文獻(xiàn)90-98
• 附錄一 攻讀博士學(xué)位期間已發(fā)表論文98-99
• 附錄二 攻讀博士學(xué)位期間參與的國家自然科學(xué)基金項目99
• 附錄三 攻讀博士學(xué)位期間參加的國際學(xué)術(shù)會議99-100
• 致謝100-102

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本文編號：844651