本文關(guān)鍵詞：多元質(zhì)粒工程技術(shù)及CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的建立與應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 合成代謝途徑 組合優(yōu)化 重組工程 基因組工程 CRISPR-Cas9 β-胡蘿卜素

【摘要】：構(gòu)建具有最優(yōu)功能的合成代謝途徑是代謝工程及合成生物學(xué)面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)。本文首先建立了多元質(zhì)粒工程(Multiplex Iterative Plasmid Engineering,MIPE)技術(shù),可以高效的對(duì)構(gòu)建在質(zhì)粒上的代謝途徑進(jìn)行組合優(yōu)化。MIPE技術(shù)利用多元ssDNA重組向質(zhì)粒中引入突變點(diǎn),對(duì)質(zhì)粒上的多個(gè)靶向位點(diǎn)進(jìn)行組合修飾,通過一個(gè)反應(yīng)能夠構(gòu)建107的質(zhì)粒文庫。同時(shí),利用質(zhì)粒DNA和ssDNA共轉(zhuǎn)策略及限制性酶切介導(dǎo)的共篩選(Restriction Digestion mediated Co-Selection,RD CoS)策略提高了質(zhì)粒ssDNA重組的效率進(jìn)而提高了MIPE引入組合突變的能力。作為對(duì)MIPE的測試,我們首先利用MIPE優(yōu)化含有5個(gè)基因的核黃素代謝途徑,在一周時(shí)間內(nèi)將核黃素產(chǎn)量提高了2.67倍。之后,我們利用MIPE同時(shí)靶向750 bp的紅色熒光蛋白的23個(gè)密碼子,在文庫中實(shí)現(xiàn)了31%的密碼子的平均突變率。之后,我們基于CRISPR-Cas9在大腸桿菌中建立一個(gè)快速、高效、可循環(huán)的基因組編輯系統(tǒng),從而為在基因組上快速、便捷的優(yōu)化代謝途徑提供了一個(gè)有價(jià)值的工具。這項(xiàng)技術(shù)能夠以接近100%的編輯效率進(jìn)行基因敲除和插入等多種遺傳操作,并且能夠同時(shí)插入三個(gè)突變點(diǎn)。我們還建立了基于CRISPR-Cas9的可誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除系統(tǒng),能夠?qū)RNA質(zhì)粒從細(xì)胞中消除,從而實(shí)現(xiàn)循環(huán)的基因組編輯,每個(gè)循環(huán)僅需兩天。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)使用有功能性的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(mismatch repair,MMR)的野生菌株可以顯著的降低細(xì)胞逃脫CRISPR切割的概率,進(jìn)而提高基因組編輯效率。為了測試這項(xiàng)技術(shù)在代謝工程中的應(yīng)用潛力,我們利用它將β-胡蘿卜素合成代謝途徑整合到了大腸桿菌基因組上,并且對(duì)甲基赤蘚糖醇4-磷酸(methylerythritol 4-phosphate,MEP)代謝途徑和中心碳代謝途徑進(jìn)行組合優(yōu)化提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量。我們一共測試了33個(gè)基因組操作,構(gòu)建了超過100個(gè)不同的菌株,其中最優(yōu)菌株含有15個(gè)基因組修飾,通過分批發(fā)酵可以生產(chǎn)2.0 g/L的β-胡蘿卜素。
【關(guān)鍵詞】：合成代謝途徑 組合優(yōu)化 重組工程 基因組工程 CRISPR-Cas9 β-胡蘿卜素
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-37
• 1.1 合成代謝途徑的組合優(yōu)化10-17
• 1.1.1 質(zhì)粒上合成代謝途徑的構(gòu)建及優(yōu)化策略11-15
• 1.1.2 多元模塊工程策略15-16
• 1.1.3 基因組上的組合優(yōu)化方法16-17
• 1.2 λ Red重組工程和多元重組技術(shù)17-27
• 1.2.1 λ Red重組系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及原理18
• 1.2.2 dsDNA介導(dǎo)的 λ Red重組18-20
• 1.2.3 ssDNA介導(dǎo)的 λ Red重組20-22
• 1.2.4 MAGE技術(shù)的原理、優(yōu)化及應(yīng)用22-26
• 1.2.5 TRMR技術(shù)的原理與應(yīng)用26-27
• 1.3 基因組編輯技術(shù)27-31
• 1.3.1 常用的基因組編輯方法簡介27-28
• 1.3.2 CRISPR-Cas基因組編輯技術(shù)28-31
• 1.4 萜類化合物及 β-胡蘿卜素的簡介及生物合成31-34
• 1.4.1 萜類化合物簡介31-32
• 1.4.2 β-胡蘿卜素簡介32
• 1.4.3 萜類化合物的生物合成32-34
• 1.5 選題背景及技術(shù)路線34-37
• 1.5.1 多元質(zhì)粒工程技術(shù)的建立與應(yīng)用34-35
• 1.5.2 基于CRISPR-Cas9的大腸桿菌基因組編輯技術(shù)的建立與應(yīng)用35-37
• 第二章 多元質(zhì)粒工程技術(shù)的建立和應(yīng)用37-70
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料37-41
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法41-52
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論52-68
• 2.3.1 MIPE技術(shù)的建立與優(yōu)化52-56
• 2.3.2 利用MIPE技術(shù)優(yōu)化核黃素代謝途徑56-62
• 2.3.3 利用MIPE技術(shù)對(duì)紅色熒光蛋白進(jìn)行組合突變62-68
• 2.4 本章小結(jié)68-70
• 第三章 大腸桿菌中CRISPR-CAS9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的建立70-86
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料70-71
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法71-73
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論73-84
• 3.3.1 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)原理73-74
• 3.3.2 測試菌株的構(gòu)建74-76
• 3.3.3 gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建策略76-78
• 3.3.4 質(zhì)粒消除系統(tǒng)和p Cas9cur質(zhì)粒的構(gòu)建78-83
• 3.3.5 利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高效的連續(xù)的基因組編輯83-84
• 3.4 本章小結(jié)84-86
• 第四章 CRISPR-CAS9介導(dǎo)的基因組編輯的表征與優(yōu)化86-104
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料86-87
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法87
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論87-102
• 4.3.1 供體DNA濃度對(duì)編輯效率的影響87-88
• 4.3.2 供體DNA同源臂長度對(duì)編輯效率的影響88-90
• 4.3.3 基因敲除和密碼子替換的效率90-92
• 4.3.4 基因插入的效率92-93
• 4.3.5 同時(shí)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行編輯的效率93-94
• 4.3.6 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的DSB對(duì)重組效率的影響94-96
• 4.3.7 MMR對(duì)假陽性菌落數(shù)量的影響96-97
• 4.3.8 MMR對(duì)基因組編輯效率的影響97-98
• 4.3.9 MMR對(duì)CRISPR-Cas9系統(tǒng)引入的突變點(diǎn)的修復(fù)98-100
• 4.3.10 λ Red系統(tǒng)、recA基因和recET基因?qū)χ亟M效率的影響100
• 4.3.11 本實(shí)驗(yàn)開發(fā)的CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的特點(diǎn)100-102
• 4.4 本章小結(jié)102-104
• 第五章 利用CRISPR-CAS9介導(dǎo)的基因組編輯進(jìn)行代謝工程104-128
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料104
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法104-106
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論106-126
• 5.3.1 在基因組中構(gòu)建 β-胡蘿卜素合成代謝途徑106-108
• 5.3.2 優(yōu)化MEP代謝途徑提高 β-胡蘿卜素產(chǎn)量108-112
• 5.3.3 優(yōu)化中心碳代謝途徑提高 β-胡蘿卜素產(chǎn)量112-116
• 5.3.4 上游和下游代謝途徑的組合優(yōu)化116-126
• 5.4 本章小結(jié)126-128
• 第六章 結(jié)論與展望128-131
• 6.1 主要結(jié)論128-129
• 6.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)129
• 6.3 展望129-131
• 參考文獻(xiàn)131-142
• 發(fā)表論文及參加科研情況說明142-143
• 附錄143-145
• 致謝145-146

【相似文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 朱金潔;CRISPR-Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點(diǎn)編輯研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 李一凡;多元質(zhì)粒工程技術(shù)及CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的建立與應(yīng)用[D];天津大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：765645