本文關(guān)鍵詞：植物脫落酸受體PYL10在脫落酸結(jié)合前后的液體核磁共振動(dòng)態(tài)特性研究

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【摘要】：蛋白質(zhì)是生物體行使功能的最重要的生物大分子之一,研究蛋白質(zhì)在生理過(guò)程中的作用機(jī)制能夠幫助我們更好的了解生命的意義。大部分蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)依賴著其動(dòng)態(tài)變化,核磁共振由于能夠研究生物大分子在不同時(shí)間尺度上的運(yùn)動(dòng)特性而成為研究蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)和作用機(jī)制的重要工具。本文應(yīng)用生物化學(xué)方法分析了植物激素脫落酸(ABA)在擬南芥中的水溶性受體家族RCAR1/PYR/PYL中的成員PYL10對(duì)其下游信號(hào)因子2C類蛋白磷酸酶PP2C的作用機(jī)制。糾正了前人因偶然因素得出“PYL10是一類不依賴于ABA的受體”的結(jié)論。本文還進(jìn)一步應(yīng)用液體核磁共振弛豫測(cè)量和約化譜密度函數(shù)分析方法揭示了PYL10在ABA結(jié)合前后的動(dòng)態(tài)特性,表明PYL10在結(jié)合ABA之后使得其結(jié)構(gòu)熵和蛋白質(zhì)柔性的增加。同時(shí),本文還介紹了發(fā)展和應(yīng)用無(wú)標(biāo)記(Label-Free)質(zhì)譜定量檢測(cè)的方法研究大腸桿菌酪氨酸激酶C端酶活結(jié)構(gòu)域(ETK-CTD)在磷酸化過(guò)程中的關(guān)鍵位點(diǎn)Tyr574的磷酸化水平的動(dòng)態(tài)變化的工作,及簡(jiǎn)要介紹了植物內(nèi)向整流鉀離子通道KAT1的初步電生理研究。 第一章先簡(jiǎn)要介紹了ABA受體的發(fā)現(xiàn)和分類。接著對(duì)水溶性的ABA受體RCAR1/PYR/PYL家族介導(dǎo)的ABA信號(hào)通路的主要內(nèi)容及其在植物體中的重要功能、RCARl/PYR/PYL家族ABA受體結(jié)合ABA時(shí)的結(jié)構(gòu)變化和發(fā)揮作用的機(jī)制進(jìn)行了重點(diǎn)介紹。 第二章主要介紹了基于液體核磁共振自旋弛豫的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析方法,并相關(guān)研究表明熱力學(xué)原理和動(dòng)力學(xué)的結(jié)合能夠更好地解釋蛋白質(zhì)-配體或者蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制。 第三章介紹了采用鉬酸鹽與磷酸根的顯色反應(yīng)檢測(cè)PYL10在體外對(duì)PP2C(HAB1)磷酸酶活性的抑制,發(fā)現(xiàn)了與之前報(bào)道的結(jié)果(ABA非依賴性)相反的結(jié)果,即ABA依賴性,且這種依賴性會(huì)受到外源蛋白牛血清蛋白(BSA)的影響。生化分析結(jié)果表明PYL10和BSA不能形成穩(wěn)定的復(fù)合物。 第四章針對(duì)BSA不是通過(guò)與PYL10直接相互作用影響其功能,可能是使PYL10蛋白的動(dòng)力學(xué)發(fā)生了變化而對(duì)功能產(chǎn)生影響。我們對(duì)自由狀態(tài)的PYL10(apo-PYL10)和結(jié)合有ABA的PYL10(ABA/PYL10)進(jìn)行了液體核磁共振主鏈歸屬、弛豫數(shù)據(jù)的采集和約化譜密度函數(shù)分析以及ABA滴定實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明PYL10對(duì)PP2C的磷酸酶活性抑制作用是通過(guò)ABA介導(dǎo)的主鏈柔性以及構(gòu)象熵的增加實(shí)現(xiàn)的。 第五章我們分別采用Label-Free質(zhì)譜相對(duì)定量和Western-blot定性分析了ETK-CTD在磷酸化過(guò)程中自磷酸化位點(diǎn)Tyr574磷酸化水平的變化和蛋白質(zhì)總磷酸化水平變化。質(zhì)譜結(jié)果表明,ETK-CTD的Tyr574位點(diǎn)的磷酸化很快達(dá)到一個(gè)較低的穩(wěn)定水平(1%)；而Western-blot結(jié)果顯示,在Tyr574達(dá)到這個(gè)穩(wěn)定水平后蛋白總體磷酸化依然升高最后保持穩(wěn)定,表明僅僅一個(gè)很低水平的自磷酸化(大約1%)已經(jīng)足夠使得蛋白質(zhì)本身完成交叉磷酸化并使蛋白達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的磷酸化水平。 第六章簡(jiǎn)單介紹了一些植內(nèi)向整流鉀離子通道KAT1的前期工作。
【關(guān)鍵詞】：液體核磁共振 弛豫 柔性 構(gòu)象熵 脫落酸受體 蛋白質(zhì)酪氨酸激酶 無(wú)標(biāo)記定量質(zhì)譜檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q946
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 目錄9-13
• 第一章 脫落酸RCAR1/PYR1/PYL受體的介紹13-29
• 1.1 脫落酸(ABA)受體的發(fā)現(xiàn)13-17
• 1.1.1 花期控制蛋白A(FCA)13-14
• 1.1.2 葉綠體的鎂離子螫合酶H亞基(ChIH)14
• 1.1.3 G蛋白偶聯(lián)受體類(GCR2>G1>G2)14-15
• 1.1.4 ABA受體調(diào)節(jié)元件/pyrabactin抵抗蛋白/pyrabactin抵抗類似蛋白(RCAR1/PYR/PYL)15-17
• 1.2 RCAR/PYR/PYL介導(dǎo)的ABA信號(hào)通路簡(jiǎn)介17-24
• 1.2.1 信號(hào)通路核心17-18
• 1.2.2 PYLs介導(dǎo)的ABA信號(hào)通路的主要功能18-20
• 1.2.3 PYLs結(jié)構(gòu)與功能的研究20-21
• 1.2.4 ABA與PYLs的結(jié)合抑制PP2Cs的機(jī)制研究現(xiàn)狀21-24
• 參考文獻(xiàn)24-29
• 第二章 基于液體NMR自旋弛豫的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析29-41
• 2.1 概述29
• 2.2 液體核磁共振研究蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的方法29-34
• 2.2.1 弛豫時(shí)間(T_1,T_2)和異核NOEs的測(cè)量29-30
• 2.2.2 譜密度函數(shù)30
• 2.2.3 Model-Free方法30-31
• 2.2.4 蛋白質(zhì)側(cè)鏈動(dòng)力學(xué)31-32
• 2.2.5 化學(xué)交換32-33
• 2.2.6 CPMG弛豫色散33-34
• 2.2.7 射頻場(chǎng)中的演化：R_(1ρ)弛豫34
• 2.3 熱力學(xué)原理在蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用34-36
• 2.4 總結(jié)36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 第三章 PYL10對(duì)PP2C的磷酸酶活性的抑制依賴ABA的作用41-57
• 3.1 前言41
• 3.2 鉬酸鹽方法定量檢測(cè)蛋白質(zhì)磷酸酶的活性41-42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)材料與方法42-47
• 3.3.1 重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建42-45
• 3.3.2 PYL10,PYL2-wt,PYL2-m與HAB1_(172-511)的過(guò)表達(dá)及純化45-47
• 3.3.3 “鉬藍(lán)”法測(cè)量PP2C磷酸酶活性47
• 3.3.4 等溫滴定量熱法(ITC)分析47
• 3.4 結(jié)果和討論47-55
• 3.4.1 PYL10、PYL2-wt、PYL2-m以及HAB1_(172-511)蛋白質(zhì)的純化48-50
• 3.4.2 PYL10對(duì)PP2C的抑制作用可能不受滲透壓的直接影響50-51
• 3.4.3 PYL10對(duì)PP2C的抑制作用可以同時(shí)被ABA和BSA增強(qiáng)51-53
• 3.4.4 ABA與PYL10的結(jié)合伴隨著焓減53-55
• 參考文獻(xiàn)55-57
• 第四章 ABA結(jié)合前后PYL10的動(dòng)力學(xué)變化57-73
• 4.1 前言57
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法57-59
• 4.2.1 用于NMR實(shí)驗(yàn)的PYL10的表達(dá)與純化57-58
• 4.2.2 NMR三維實(shí)驗(yàn)和主鏈歸屬58-59
• 4.2.3 主鏈弛豫測(cè)量59
• 4.2.4 ABA滴定實(shí)驗(yàn)59
• 4.3 結(jié)果和討論59-68
• 4.3.1 PYL10在有無(wú)ABA存在下的液體核磁共振的主鏈歸屬59-60
• 4.3.2 ABA/PYL10在納秒尺度上的柔性比apo-PYL10大60-64
• 4.3.3 約化譜密度函數(shù)J(0)在apo-PYL10和ABA/PYL10結(jié)構(gòu)上的映射64-65
• 4.3.4 ABA滴定過(guò)程中PYL10的構(gòu)象交換65-68
• 4.4 總結(jié)和展望68-70
• 參考文獻(xiàn)70-73
• 第五章 運(yùn)用Label-Free質(zhì)譜定量分析大腸桿菌酪氨酸激酶ETK催化結(jié)構(gòu)域的磷酸化變化73-99
• 5.1 背景介紹73-81
• 5.1.1 細(xì)菌酪氨酸激酶的介紹73-74
• 5.1.2 大腸桿菌K12酪氨酸激酶(ETK)的研究現(xiàn)狀74-77
• 5.1.3 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)的定量檢測(cè)方法77-81
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法81-85
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及質(zhì)粒來(lái)源81
• 5.2.2 ETK-CTD和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)蛋白的表達(dá)純化81-82
• 5.2.3 免疫印跡(western-blot)檢測(cè)82
• 5.2.4 體外激酶活性實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)82-83
• 5.2.5 質(zhì)譜檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析83-85
• 5.3 結(jié)果與討論85-94
• 5.3.1 ETK-CTD和PTP1B蛋白質(zhì)的純化85-86
• 5.3.2 體外磷酸化實(shí)驗(yàn)以及質(zhì)譜樣品的制備86-87
• 5.3.3 液相串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)能檢測(cè)的胰蛋白酶酶切的ETK-CTD肽段87-88
• 5.3.4 LC-MS/MS檢測(cè)ETK-CTD的磷酸化肽段88-90
• 5.3.5 定量分析ETK-CTD中Tyr574位點(diǎn)磷酸化水平的變化90-92
• 5.3.6 用western-blot檢測(cè)ETK-CTD的總體磷酸化變化92-94
• 5.4 討論和總結(jié)94-95
• 參考文獻(xiàn)95-99
• 第六章 植物內(nèi)向整流鉀離子通道KAT1的功能研究初探99-111
• 6.1 背景介紹99-103
• 6.1.1 植物鉀離子通道的分類99-100
• 6.1.2 KAT1的研究現(xiàn)狀100-103
• 6.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法103-105
• 6.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建103-104
• 6.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和電生理記錄104-105
• 6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論105-108
• 參考文獻(xiàn)108-111
• 附錄1 培養(yǎng)基的配制111-112
• 附錄2 緩沖溶液的配制112-114
• 致謝114

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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